초록 ▼

Ⅳ. 연구개발 결과
이 연구에서는 1) 미강 발효 및 추출공정 확립과 건강기능성 식품 및 제품화, 2)미강발효추출물이 ADP수용체가 매개하는 혈전증병리현상인 혈소판응집 신호전달 표적의 억제특이성 규명, 3) 미강발효추출물의 뇌질환 예방 및 기능개선 응용을 위한 생리활성 연구를 수행하였다.
첫 번째로, 미강 발효 및 추출공정 확립과 건강기능성 식품 및 제품화는 아래와 같다.
1) 미강원료의 품질 안정화를 위한 전처리 조건을 확립하기 위해 가열처리를 통한 오염세균 제거와 효소의 불활성화를 D값을 가열온도별로 log(Ce

Ⅳ. 연구개발 결과
이 연구에서는 1) 미강 발효 및 추출공정 확립과 건강기능성 식품 및 제품화, 2)미강발효추출물이 ADP수용체가 매개하는 혈전증병리현상인 혈소판응집 신호전달 표적의 억제특이성 규명, 3) 미강발효추출물의 뇌질환 예방 및 기능개선 응용을 위한 생리활성 연구를 수행하였다.
첫 번째로, 미강 발효 및 추출공정 확립과 건강기능성 식품 및 제품화는 아래와 같다.
1) 미강원료의 품질 안정화를 위한 전처리 조건을 확립하기 위해 가열처리를 통한 오염세균 제거와 효소의 불활성화를 D값을 가열온도별로 log(Cell count) vs time 관계를 이용하여 산출하였고, 유용성분 추출법 확립을 위해 미강발효 추출물의 GABA와 ferulic acid 함량 profile과 제 2와 3세부과제 결과를 비교 분석하여 GABA를 지표물질로 선정하였으며, 초고압추출로 지표물질 추출수율을 증진시켰으며, 분리균주 Lw가 제2, 3세부과제에서 우수한 효과를 도출하였으며, 이를 동정하여 특허기탁하였다(KFCC 11556P).
2) 복합발효균주를 이용한 유용성분 증진을 위해 그존 L.p와 L.w외 L.k 균주와의 조합효과를 평가한 결과 단일균주로만 발효했을 때 보다 GABA수율 증진효과가 있었으며, 미강배지에 MSG 1%를 첨가한 경우 현저한 GABA 생산증진효과가 있었습니다. 특히, Compound X는 L.w 발효물에만 존재하며, 이의 수율은 ferulic acid 첨가로 크게 높일 수 있었다.
3) 미강발효추출물의 제품화를 위하여 원료의 안정성확보단계부터 발효추출 단위공정별 물질수지 평가 및 기본공정설계를 작성하였고, 미강발효추출물을 분획하여 얻은 Sample을 이용하여 TLC와 HPLC 분석을 통해 compound X의 특성 규명하였으며, HPLC retention time과 spectra를 ferulic acid 대사물질들과 비교하여 기본구조를 추정하였다.
4) 발효기 사용한 미강발효 최적조건수립 미강 발효추출물의 가공적성에 따른 용도검토를 위하여 초고압, 열처리, pH변화 등에 따른 GABA함유량을 비교분석한 결과, 발효기사용 최적조건 (미강 고형물비 1:10, 온도 35℃, 교반조건 0~100rpm)을 확립하였고, 미강발효추출물에 함유된 GABA는 열처리는 121℃에 30분, pH조건은 pH 4-7, 초고압은 2000psi에 10분 처리에도 안정하였다.
5) 발효공정의 최적화를 위하여 3가지 factor와 3단계 level로 실험하여 RSM 분석을 실시하였다. 그 결과, 0.0545% 페룰산을 첨가한 미강배지에서 발효온도 34.4℃, 발효시간 45.84시간으로 발효를 마치면 HFA가 최대치인 142.4mg/L 생산되는 것으로 예측하였다. 동일 조건에서 미강발효를 실시하여 HFA 생산량을 측정한 결과, 148.2mg/L였다. 이로써 최적화 모델식이 HFA생산량을 성공적으로 예측하고 있음을 추정할 수 있었다. 또한 유효성분 분리공정을 두종류의 소재를 모델로 하여 설계, 시험하여 유효성분의 함량에 따라 고HFA 소재와 저HFA소재로 생산하였다. 또한 소재의 지표성분에 대한 공정 중 가혹조건하 안정성 시험을 하였고, 이의 안정성을 확인하였다.
6) Rat을 실험동물로 하여 복강주사로 뇌경색 예방과, 우울증 경감효과 및 인지능력 향상 실험을 한 결과 1회 복강으로 주입한 HFA는 0.055mg이었으며 이때 rat의 평균 체중은 250g이었다. 체중이 60kg인 성인을 기준으로 한 유효투여량은 아래 계산에 따라 2.14mg HFA이다. 이러한 기준으로 뇌경색 예방모델에 실시한 식이실험의 결과는 복강실험의 결과와 일치하였다.
7) 농축 미강발효액 (Brix 28%)을 말토덱스트린 (DE 22, 10, 5)와 2:1의 비율로 혼합하여 분무건조하여 소재화하였다. 입구 온도 180·℃, 출구 온도 80℃로 하였으며 분사속도는 8,525rpm이었다. 분무건조분말의 bulk density는 0.776, 수분함량은 3.63%였다. 농축 미강발효액을 동결건조하여 소재화 하였다. 동결온도, -47 ℃; 진공도, 18 Pa; 건조시간, 48시간으로 처리하였으며, 동결건조분말의 bulk density는 0.694이고, 수분함량은 8.97%였다. 미강발효 소재가 가장 쉽게 시장에 진입하는 모델제품으로 우유나 쥬스에 혼합하여 음용하는 분말요구르트형 제품을 설계하였다. 분무건조분말 또는 동결건조 분말을 사용할 수 있는데, 요구르트형 제품에는 부형제가 들어있지 않은 동결건조분말을 주 재료로 사용하였다.
두 번째로, 미강발효추출물이 ADP수용체가 매개하는 혈전증병리현상인 혈소판응집 신호전달표적의 억제특이성 규명의 연구결과는 아래와 같다.
1) ADP는 adenylate cyclase(AC)의 활성을 억제시킴으로써 ATP로부터 cAMP의 생성을 억제시킨다. 이것은 IP₃ receptor가 매개하는 [Ca²⁺]_i의 증가와 깊은 연관성을 가지고 있다. 하지만 Lw는 cAMP의 생성을 증가시키고(1차년도 연구결과), 이것을 이용하여 IP₃R을 인산화시킴으로써 [Ca²⁺]_i의 동원을 억제시킨다(3차년도 연구결과). 또한 Lw가 증가시킨 cAMP는 VASP를 인산화시켜 혈소판응집반응을 억제시켰다(1차년도 연구결과).
2) 혈소판의 세포질에 동원된 [Ca²⁺]_i은 myosin light chain kinase (MLCK)와 PKC의 활성을 촉진시킨다. MLCK의 활성촉진에 의해 myosin light chain (MLC)가 MLC-p로 인산화된다. PKC의 활성촉진에 의해 pleckstrin이 pleckstrin-p로 인산화된다. 인산화된 MLC-p와 pleckstrin-p는 serotonin/ATP release 반응에 관여하여 혈소판응집을 촉진시킴으로써 혈전형성을 강화시킨다. 그러나, Lw는 ADP에 의한 [Ca²⁺]_i 동원 → MLC의 인산화(MLC-p) → pleckstrin 인산화(pleckstrin-p) → serotonin/ATP release 촉진 → 혈소판응집반응 촉진 → 혈전의 강화하는 일련의 ADP매개 혈소판응집분자의 활성을 억제시켰다(3차년도 연구결과)
3) 또한, ADP는 cyclooxygenase-1 (COX-1)의 활성을 촉진시켜 arachidonic acid로부터 혈소판응 집촉진분자인 thromboxane A₂ (TXA₂)의 생성을 촉진시킨다. 그러나, Lw는 COX-1의 활성을 억제시킴으로써 TXA₂의 생성을 억제시켜 항혈소판작용을 가진다는 것을 명확히 했다.
4) Lw를 rat의 복강으로 투여한 후 얻은 혈소판과 혈장으로 혈소판응집반응과 혈액응고반응에 미치는 영향을 조사한 결과, Lw 투여에 의해 혈액응고가 억제되고, 혈소판응집반응 또한 억제되었다(2차년도 연구결과, 3세부과제와의 연관성 확인).
5) Lw를 rat의 복강으로 투여한 후 혈액중의 안전성평가지표(각종 질환 관련 지표)를 측정한 결과, 간질환, 심장질환, 근육/골격근질환, 췌장질환, 신장질환 관련 지표는 혈액 중에 증가하지 않았다. 즉, 간, 심장, 근육/골격근, 췌장 및 신장의 기능을 정상적으로 유지시킨다(3차년도연구결과). 또한, Lw 투여시 food intake와 체중증가분의 감소를 통해 Lw가 체중을 감소시키는 다이어트 효과를 가져올 수 있다고 생각된다(3차년도 연구결과).
세 번째로, 미강발효추출물의 뇌질환 예방 및 기능개선 응용을 위한 생리활성 연구 결과는 아래와 같다.
1) 뇌졸중 동물모델에서 예방 및 기능개선 조사에서는 허혈성 뇌졸중이 발생되면 infarct이 생성됨과 동시에 여러 가지 항산화 유전자와 신경조절물질들이 감소하게 된다. 또한, apoptosis가 증가하게 되며 따라서 neuronal cell death가 일어난다. 미강열수추출물(RB)을 이용해 뇌졸중의 신경학적 기능 회복을 검증하였다. 허혈성 뇌졸중의 infarct이 감소됨을 TTC염색을 통해 확인되었고, RT-PCR을 통하여 항산화 유전자인 PDI, Nrf2가 증가됨을 확인하였다. 그리고 신경조절물질인 BDNF, NGF, GDNF 또한 증가함을 보였다. 뇌졸중에 의한 apoptotic cells의 수를 측정한 결과, 미강열수추출물을 처리한 실험동물의 cortex와 striatum에서 감소함을 보였다. 그리고 Immunohistochemistry를 통해 신경세포를 해마에서 detection한 결과, 미강열수추출물을 처리한 실험동물에서 신경세포들이 증가함을 나타내었다. 미강열수추출물의 구성성분중의 하나인 Ferulic acid(FA)는 항산화 증진효과가 있음을 나타낸 논문들이 있다. 이를 통해 실험동물에 각각 처리된 미강열수추출물과 FA가 신경학적 기능회복에 효과를 실험을 통하여 확인하였다. 그리고 발효미강추출물(L,p, L.p+L.w, L.w) 또한 뇌졸중의 infarct과 행동평가에서 신경학적 기능회복을 검증하였다.
2) 우울증 / 불안장애 동물모델에서 예방 및 기능개선 조사에서는 Restraint stress를 통해 유도된 우울증/불안장애 실험동물에서 미강열수추출물과 발효미강추출물(L.w)이 행동평가에서 회복이 있었다. 우울증 행동평가인 Forced Swimming Test(FST)를 통해 발효미강추출물에서 immobility time이 줄어듦을 확인하였다. 그리고 불안장애 행동평가인 Elevated Plus Maze test(EPM)에서도 발효추출물을 처리한 실험동물이 open arms time이 증가함을 확인하였다. 따라서 발효미강추출물(L.w)은 우울증과 불안장애와 같은 실험동물에서 행동평가의 향상효과가 있음을 검증하였다.
3) 세포배양을 이용한 Compound X(SCX/3)의 BDNF, NGF, GDNF, 신경회로, 항산화 유전자들의 발현에 대한 평가 는 SCX/3의 주요 성분이 dFA임을 밝혀냈다. SCX/3, FA, dFA에서 생존율이 통계적으로 유의하게 높았고 dFA가 생존율이 제일 높다. dFA를 농도별로 처리하였을 때 50μM까지 점차적으로 생존율이 높았다.
4) Compound X(SCX/3)를 사용하여 뇌경색 모델에서 뇌세포 사멸, 신경회로망, 신경영양유전자 발현을 sham 대조군과 비교 평가는 SCX/3를 쥐의 복강에 3일간 주사한 후 흰 쥐 뇌 손상은 통계적으로 유의하게 줄어들었으며 이에 따른 신경 기능 회복은 유의하게 개선되었다. L.w에 의하여 뇌세포 사멸은 감소하였으며 신경회로망 관련 유전자인 SYP, ChAT, DCX등의 발현은 증가하였다
5) 뇌경색 모델에서 Compound X(SCX/3)를 함유하는 L.w 추출물에 의한 인지 기능 평가는 MCAO 수행 후 흰 쥐를 water maze test하였을 때 positive control인 DPZ와 L.w group은 vehicle group보다 통계적으로 유의하게 escape latency가 감소하였고, retention time이 증가 하였다. 또 NOR test를 하였을 때 DPZ와 L.w group은 vehicle group보다 새로운 물체를 탐색 하는 시간이 더 많았다. L.w는 뇌경색 흰 쥐의 학습과 기억을 개선시킨 것으로 추측된다.

Abstract ▼

Ⅳ. Results
- part 1
1) From these results we conclude that the fermentation of rice bran by Lactobacillus plantarum KCCM 12116 (LP) and Lactobacillus plantarum KFCC 11556P (LW) starter cultures showed significantly increase on antioxidant assay values (TPC, DPPH, FRAP, and ORAC) compared to no

Ⅳ. Results
- part 1
1) From these results we conclude that the fermentation of rice bran by Lactobacillus plantarum KCCM 12116 (LP) and Lactobacillus plantarum KFCC 11556P (LW) starter cultures showed significantly increase on antioxidant assay values (TPC, DPPH, FRAP, and ORAC) compared to non-fermented rice bran. In vivo experiment was also confirmed that the rice bran fermented had an effect to reduce a total infarct volume of ischemia brain injury in the rat model. In addition, rice bran fermentations were able to metabolize the ferulic acid to other bioactive compounds during fermentation. This leads to a consideration of what the metabolites and bioactive compounds converting after fermentation of rice bran are and what a suitable of fermentation condition to produce these compounds.
2) From the results obtained in this part, it is possible to state that FA is a precursor of compound X production in the rice bran fermentation by LW strain. Suitable fermentation condition in the rice bran media supplemented with 0.01% FA to produce the compound X was discovered at 35℃ for 36 hours. Preliminary purification was done by PREP-HPLC and LC/MS. Among 5 fractions received from PREP-HPLC, fraction 4 contained the highest content of compound X. Further analysis was done by LC/MS and found that the compound X might be a hydroferulic acid. Conversion product of LW cell-free extract incubated in 0.01 % FA media was also investigated. Possible pathway of compound X production might occur by the inducible reductase enzyme from 4VG. In addition, in vivo experiment on ischemia effect in the rat treated with SCX/3 (fraction 4) showed percent total infarct volume less than the control group.
3) The experimental design approach allowed the determination of the significant effects and polynomial functions that describe the effects of LW fermentation condition of rice bran on compound X production yield. RSM was successfully employed to determine the optimal fermentation variables to obtain the maximum compound X yield. A polynomial regression model was proposed to reasonably describe the experimental results, and based on the proposed model, the optimal LW fermentation condition of rice bran for compound X production was found to be at 34.5°C, 45.8 h, with addition of FA at 0.0545% w/v. At this condition, the predicted compound X yield was 142.34 mg/L. Thus, from the present study it can be concluded that compound X production can be improved by controlling various factors simultaneously viz. fermentation time, fermentation temperature, and percent FA addition and this interaction could only be well understood by suitable RSM selection.
- part 2
1) ADP inhibits adenylate cyclase (AC), cAMP production enzyme from ATP, and amplifies platelet aggregation. This involves in IP3 receptor (IP3R)-mediated [Ca²⁺]_i mobilization. But rice bran extract Lw elevated the cAMP production (1st year study) and inhibited [Ca²⁺]_i mobilization via phosphorylation of IP3R (3^rd year study), and phophorylated VASP (Ser¹⁵⁷) to inhibit platelet aggregation(1st year study).
2) Mobilized [Ca²⁺]_i activates myosin light chain kinase (MLCK) and protein kinase C (PKC). Myosin light chain (MLC) is phosphorylated by MLCK and pleckstrin is phosphorylated by PKC. Phosphorylated MLC (MLC-p) and pleckstrin (pleckstrin-p) involve in serotonin/ATP release, and amplify platelet aggregation. Lw inhibited ADP-induced platelet aggregation molecules activation cascade that intensifying thrombus formation [ADP-induced [Ca²⁺]_i mobilization → MLC phosphorylation (MLC-p) → pleckstrin phosphorylation (pleckstrin-p) → serotonin/ATP release → platelet aggregation → intensification of thrombus] (3^rd year study).
3) ADP activates cyclooxygenase-1 (COX-1) activity, producing thromboxane A₂ (TXA₂), aggregation-inducing molecule, from arachidonic acid. But Lw inhibited TXA₂ production via inhibition of COX-1 activity, inhibiting platelet aggregation (2^nd year study).
4) After intraperitoneal administration of Lw to rat, rat platelet aggregation and blood coagulation were inhibited compared control (saline) (elucidation of correlation between anti-thrombotic and brain function improving activities, 2^nd year study).
5) After intraperitoneal administration of Lw to rat, disease (liver, heart, muscle/skeletal muscle, pancreas, kidney disease)-related parameters in blood were not changed(3^rd year study). Lw administration could be good for diets because of reducing food intake and weight increasement(3^rd study).
- part 3
1) The effect of fermented rice bran extract on the animal model of brain diseases. Our findings indicate that L.w treatment showed the largest effects in functional recovery and cognitive improvement after ischemic brain injury through stimulation of the acetylcholine receptor, antioxidant genes, neurotrophic factors, and expression of NeuN, SYP, DCX, and ChAT. In our results, administrations of L.w exerted anxiolytic/anti-depressant effect by behavior test. It also lowered CORT levels and suppressed body weight loss following repeated RS. The L.w treatment not only protected neuronal cells in the hippocampus by apoptosis but also increased the expression of neurotrophic factors, BDNF, NGF and GDNF. The immuno-histochemical investigation revealed that the L.w treatment prevented severe loss of synaptic vesicle marker, SYP and increased intensity of the serotonergic neurons.
2) The effect of compound X, an active fraction of fermented rice bran extracts on the neural cells and animal model. Compound X promoted the survival rate of pc12 cells in the H₂O₂ media through the expressions of NGF, PDI and Nrf2 genes. L.w and compound X reduced the brain injury and promoted functional recovery in a rat model of ischemic brain through the stimulation of antioxidant and neural trophic factor genes.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 2
• 요 약 문 ... 3
• SUMMARY ... 19
• CONTENTS ... 25
• 목차 ... 26
• 제 1장 연구개발과제의 개요 ... 27
• 제 1절 연구개발의 목적 ... 27
• 제 2절 연구개발의 필요성 ... 27
• 제 3절 연구범위 ... 30
• 제 2장 국내외 기술개발 현황 ... 33
• 제 1절 국내 제품 및 시장 현황 ... 33
• 제 2절 국외 제품 및 시장 현황 ... 34
• 제 3장 연구개발 수행 내용 및 결과 ... 35
• 제 1절 미강 발효 및 추출공정 확립과 건강기능성 식품 및 제품화 ... 35
• 제 2절 미강발효추출물이 ADP수용체가 매개하는 혈전증병리현상인 혈소판 응집 신호전달 표적의 억제특이성 규명 ... 91
• 제 3절 미강 발효 추출물의 뇌질환 예방 및 기능개선 응용을 위한생리활성 연구 ... 136
• 제 4장 목표 달성도 및 관련분야 기여도 ... 175
• 제 5장 연구개발 성과 및 활용계획 ... 179
• 제 1절 연구개발 성과 ... 179
• 제 2절 연구성과 활용 ... 181
• 제 6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 183
• 제 7장 연구 시설·장비 현황 ... 184
• 제 8장 참고문헌 ... 185
• 첨부:특허, 논문, 제품(시장) 분석보고서 ... 187
• 끝페이지 ... 193