보고서 정보
주관연구기관 |
대구가톨릭대학교 Catholic University of Daegu |
연구책임자 |
허용
|
참여연구자 |
김형아
,
정태천
,
김창열
,
강미정
,
라비 가우탐
,
조아랑
,
이재희
,
송은섭
,
김연경
,
신소정
,
캐서린 로크
|
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2016-12 |
과제시작연도 |
2016 |
주관부처 |
환경부 Ministry of Environment |
등록번호 |
TRKO201700008030 |
과제고유번호 |
1485014254 |
사업명 |
국립환경과학원연구사업 |
DB 구축일자 |
2017-10-12
|
DOI |
https://doi.org/10.23000/TRKO201700008030 |
초록
▼
Ⅳ. 최종 연구 결과
◦ 시험대상 생활환경 유해 화학물질의 피부감작성 평가에 대한 기존 연구 요약 :
- Ethylene glycol의 알레르기성 접촉성 피부염을 유발할 수 있는 피부감작능에 대한 기존 연구 결과를 분석한 결과 독성 평가 관련 국제적 기관 모두에서 경증의 피부 자극성은 유발하지만 피부감작능은 없는 것으로 보고.
- Citral의 경우 실험동물을 이용한 연구 및 사람을 대상으로 평가한 거의 모든 연구에서 약 감작성능이 (weak sensitizer) 있는 것으로 보고.
- DDAC의 피부감
Ⅳ. 최종 연구 결과
◦ 시험대상 생활환경 유해 화학물질의 피부감작성 평가에 대한 기존 연구 요약 :
- Ethylene glycol의 알레르기성 접촉성 피부염을 유발할 수 있는 피부감작능에 대한 기존 연구 결과를 분석한 결과 독성 평가 관련 국제적 기관 모두에서 경증의 피부 자극성은 유발하지만 피부감작능은 없는 것으로 보고.
- Citral의 경우 실험동물을 이용한 연구 및 사람을 대상으로 평가한 거의 모든 연구에서 약 감작성능이 (weak sensitizer) 있는 것으로 보고.
- DDAC의 피부감작능에 대한 기존 연구 결과, 피부감작성 유무에 대해 다양한 연구 결과가 보고됨. 미국 환경청은 피부감작성을 유발하지 않는다고 보고한 바도 있지만 직업적 노출에 따른 피부 관련 증례 보고도 되고 있음. 종합적으로 DDAC는 피부감작능은 있지만 그 potency는 아직까지는 결론짓기에는 이르다고 판단됨.
◦ 생활환경 유해 화학물질에 대한 DPRA 시험 수행 결과 :
- DPRA 시험법 수행 정도관리 차원 proficiency test 수행 (OECD TG 442C 등재 10개 물질) 결과 6-methylcoumarin 제외 9개 물질에 대해 cysteine peptide depletion % 및 lysine peptide depletion %가 TG Annex 2에 기술된 범위에 들어와 숙련도 확인됨.
- 양성대조물질, 음성대조물질의 경우 모두 TG에 적시된 depletion % 범위에 속하였고, DDAC, citral, ethylene glycol 각각에 대해 “single substance”로 시험한 결과, DDAC의 경우 cysteine depletion %는 0%, lysine depletion %는 0.58%, 평균 depletion %는 0.29%로 피부감작능에 대한 최종 판정은 “음성”이었음. citral의 경우 cysteine depletion %는 22.836%, lysine depletion %는 17.11%, 평균 depletion %는 19.97%로 피부감작능에 대한 최종 판정은 “양성 (low reactivity)”이었음. EG의 경우 cysteine depletion %는 1.46%, lysine depletion %는 3.79%, 평균 depletion %는 2.63%로 피부감작능에 대한 최종 판정은 “음성”이었음.
- DDAC와 ethylene glycol을 9:1, 4:1, 7:3, 1:4로 혼합한“mixed substance”로 2회 반복 시험 한 결과, 1차 시험 결과 모든 희석 배수에서 cysteine depletion은 0.24~3.92%, lysine depletion은 0.00~2.05 %, 평균 depletion %는 0.64~2.40% 로 피부감작능 최종 판정은 “음성”이었음. 2차 시험 결과 9:1, 4:1, 7:3 희석 배수에서는 cysteine depletion은 3.64~6.00 %, lysine depletion은 0.76~5.87 %, 평균 depletion %는 2.20~5.94 %로 피부감작능 “음성”이었지만, 1:4 희석 배수에서는 cysteine depletion은 12.07 %, lysine depletion은 5.37%, 평균 depletion %는 8.72 %로 피부감작능“양성 (low reactivity)”이었음.
◦ 생활환경 유해 화학물질에 대한 h-CLAT 시험 수행 결과 :
- EURL ECVAM DB-LAM Protocol No. 158에 의거하여 reactivity check 시험을 수행한 결과 피부감작성 양성 참조 물질인 DNCB, nickel sulfate와 음성 참조 물질인 lactic acid 처리에 따른 THP-1 세포 CD86 RFI (positive: ≥150%), CD54 (positive: ≥200%) 수준을 매 세포 batch 마다 평가하였을 때, DNCB : CD86 RFI (309.9~447.7 %), CD54 RFI (255.2~736.7 %), nickel sulfate : CD86 RFI (178.3~225.0 %), CD54 RFI (912~7762 %), lactic acid : CD86 RFI (85.3~110.7 %), CD54 RFI (156.3~189.5 %)로 피부감작능 양성, 음성 기준치에 부합하였음.
- DDAC, citral, EG 각각에 대해 dose finding assay를 수행하여 결정된 CV75 농도를 이용하여 CD54, CD86 발현 정도를 분석한 결과, ethylene glycol의 경우 3회 반복 시험모두에서 어느 농도에서도 CD86 RFI (positive: ≥150%), CD54 (positive: 200%)를 넘지 않아 피부감작성이 없는 “음성”으로 판정되었음. DDAC의 경우 3회 반복시험 중 CD86 RFI (positive: ≥150%)는 1회에서, CD54 (positive: ≥200%)는 3회 모두에서 피부감작성 기준치를 넘었고 이에 “피부감작성이 있는 물질, 즉 skin sensitizer”로 판정되었음. Citral의 경우 CV75 농도를 24 ㎍/㎖로 3회 반복 시험한 결과에서는 3회 모두에서 피부감작성 기준치를 넘었음. 이에“피부감작성이 있는 물질, 즉 skin sensitizer”로 판정되었음.
- DDAC, citral 각각에 대해 EG 부형제를 7:3, 1:4로 혼합한 혼합물질에 대해 시험한 결과, DDAC:ethylene glycol=7:3 혼합물의 경우 3회 반복시험 모두에서 “양성”으로 판정되었고 1:4 혼합물 역시도 3회 반복시험 모두에서 “양성”으로 판정되었음. Citral:ethylene glycol=7:3 혼합물의 경우 3회 반복시험 중 2회에서 “양성”결과가 도출되어 최종적으로는 “양성”으로 판정됨. 1:4 혼합물 역시도 2회에서 “양성”결과가 도출되어 최종적으로는 “양성”으로 판정됨.
◦ 국내 외 동물대체시험법 관련 현황 조사 결과, OECD TG 공인 시험법 중에서 국립환경과학원에서는 [화학물질의 시험방법에 관한 규정 (고시번호 제2015-8호)]에 따라 human health 분야의 33개 시험법에 관해 고시하고 있었음. 다른 부처와 달리 국립환경과학원에서는 human health 시험분야 외에도 물리화학적 성질 분야의 20개 시험법, 생태 영향 분야의 15개 시험법, 분해성 및 농축성 분야의 14개 시험법도 [화학물질의 시험방법에 관한 규정]에 고시하고 있었음.
◦ 생활화학용품 함유 혼합물질 노출에 따른 피부과민성 연구문헌 조사 결과, 현재까지 생활화학용품에 함유된 혼합물질을 기반으로 면밀하게 독성을 평가한 경우는 국립환경과학원의 [혼합물질 유해성평가를 위한 흡입독성 스크리닝 기법 연구 (2014)]를 제외하면 그렇게 많지 않은 실정임. 생활화학용품에 존재하는 단일 화학성분에 관한 독성평가는 국내․외적으로 많이 진행되어 왔음. 혼합물질에 대한 동물대체시험법 적용시험이 아직 연구초기 단계로 그렇게 활성화 되지 않아서 citral 뿐만 아니라 DDAC에도 적용된 사례가 그렇게 많지는 않음. 피부모델을 사용한 in vitro 대체시험법이 DDAC에 적용된 예는 없었음. EG에 대하여 동물대체시험법을 적용한 연구사례는 많지 않은 실정이며, 피부감작성 시험법에 적용한 연구사례도 거의 없는 실정임.
◦ EURL-ECVAM, JaCVAM, ICCVAM 등에서 피부과민반응의 [Key Event]에 맞춰 여러 가지 동물대체시험법이 개발 및 검증과정 중에 있는데, 피부과민반응의 [Key Event 1]과 관련된 대체시험법으로 DPRA가 국제 공인시험법이며, DPRA와 유사한 기전으로 PPRA (Peroxidase Peptide Reactive Assay) 등의 대체시험법이 연구되고 있음. [Key Event 2]와 관련된 대체 시험법으로는 KeratinoSens가 국제 공인시험법이며, KeratinoSens와 유사한 기전으로 LuSens가 있고, 그 외에도 NCTC, SenCeeTox, AREc32 등의 대체시험법이 연구되고 있음. [Key Event 3]와 관련된 피부과민성 대체시험법으로는 h-CLAT가 국제 공인시험법이고 Key event 3을 타겟으로 MUSST, GARD, Sensi-Derm, VITOSens, PBMDC 등의 대체시험법이 연구되고 있음.
(출처 : 요 약 문 5p)
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 제출문 ... 2
- 요약문 ... 3
- 목차 ... 8
- 표목차 ... 11
- 그림목차 ... 12
- I. 서 론 ... 13
- 1. 연구의 배경 ... 13
- 가. 대체시험법 개발에 대한 국제적 동향 ... 13
- 나. 대체시험법 개발에 대한 국내 현황 ... 15
- 다. 피부감작성 평가 대체시험법에 대한 국제적 현황 ... 16
- 라. 피부감작성 평가 대체시험법에 대한 국내 개발 현황 ... 17
- 2. 연구의 필요성 ... 19
- 가. 생활환경용품 함유 혼합화학물질의 안전성 평가 ... 19
- 나. 생활환경화학물질을 포함한 일반 환경 노출 유해인자의 피부감작능 평가 국제 공인 시험법 확립 ... 19
- 3. 연구의 목적 ... 21
- II. 연구내용 및 방법 ... 22
- 1. 생활용품 함유 주요 혼합물질의 피부알레르기 유발 가능성에 대한 문헌 조사 ... 22
- 가. 국내·외 문헌조사를 통한 혼합물질 피부감작유발 가능성 자료 확보 및 분석 ... 22
- 나. 국내·외 문헌조사를 통한 혼합물질 피부감작성에 대한 대체시험법 연구 현황 분석 ... 23
- 다. 국내·외 대체시험법 관련 현황 조사 ... 23
- 2. 피부감작성 평가 대체시험법 수행 ... 24
- 가. Direct peptide reactivity assay (DPRA) 및 Human Cell Line Activation Test (h-CLAT) 시험법의 과학적 배경 ... 24
- 나. Direct peptide reactivity assay (DPRA) 수행 ... 25
- 다. Human Cell Line Activation Test (h-CLAT) 수행 ... 33
- 3. 연구 추진 체계 ... 40
- 가. 연구 수행 전체 조직도 ... 40
- 나. 동물대체시험법 기존 연구에 대한 문헌조사 전략 ... 40
- 다. 각 연구 수행 분야 인력 현황 및 업무 분장 ... 41
- III. 연구 결과 및 고찰 ... 43
- 1. 시험대상 생활환경 유해 화학물질의 피부감작성 평가에 대한 기존 연구 요약 ... 43
- 2. Direct peptide reactivity assay (DPRA) ... 46
- 가. HPLC standard curve 생성 및 만족 조건 ... 46
- 나. Proficiency test 결과 ... 47
- 다. 단일 물질 본시험 결과 ... 49
- 라. 혼합 물질 본시험 결과 ... 50
- 마. 시험 수행 결과에 대한 acceptance criteria 검토를 통한 신뢰성 평가 ... 52
- 3. human-Cell Line Activation Test (h-CLAT) ... 53
- 가. h-CLAT 본시험 수행 관련 사용 THP-1 세포주 quality assurance (THP-1 세포주 doubling time monitoring) ... 53
- 나. h-CLAT 본시험 수행 관련 사용 THP-1 세포주 quality assurance (THP-1 세포주 reactivity check) ... 54
- 다. 단일 물질 본시험 결과 ... 58
- 라. 혼합 물질 본시험 결과 ... 63
- 4. DDAC, citral, ethylene glycol 단독/혼합 물질에 대한 DPRA와 h-CLAT 시험에 따른 피부감작능 판정 비교분석 ... 67
- 가. 피부감작능 판정결과 요약 ... 67
- 나. 판정결과에 대한 고찰 ... 67
- 5. 생활용품 함유 주요 혼합물질의 피부 알레르기 유발 가능성에 대한 문헌 조사 및 국내 외 대체시험법 관련 현황 조사 ... 69
- 가. 국내 외 동물대체시험법 관련 현황 조사 ... 69
- 나. 생활화학용품 함유 혼합물질 노출에 따른 피부감작성 연구문헌 조사 ... 87
- 다. 혼합물질에 대한 동물대체시험법 적용을 위한 제언 ... 120
- 6. 고찰 (DPRA 시험 및 h-CLAT 시험에 따른 피부감작능 판정 연계 분석) ... 122
- 가. 연계 분석의 중요성 ... 122
- 나. 연계 분석을 통한 판정시 고려할 점 ... 123
- 다. DDAC 피부감작성 판정에 대한 DPRA/h-CLAT 차이점 토의 ... 124
- 라. Citral:EG 혼합물에 대한 h-CLAT 시험에서 3회 반복 시험에서 1회 상이한 결과에 대한 토의 ... 125
- IV. 기대성과 및 활용방안 ... 127
- 1. 기대성과 ... 127
- 가. 정책적 기대성과 ... 127
- 나. 기술적 기대성과 ... 127
- 2. 활용방안 ... 127
- V. 참고문헌 ... 130
- VI. 부록 ... 137
- 부록1. 대표적인 HPLC 분석 크로마토그램 ... 137
- 부록2. Direct Pepetide Reactivity Assay 핵심 시험 과정 ... 147
- 부록3. human-Cell Line Activation Test (h-CLAT) 핵심 시험 과정 ... 155
- 끝페이지 ... 160
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