초록 ▼

▣ 연구개발사업의 목표
○ 간암의 진단 도구 및 표적치료제로서 적용 가능한 새로운 압타머 발굴 및 (전)임상 진입 가능한 안정한 압타머 제제 개발
1) 간암 타겟 압타머 발굴
2) 압타머 제제 개발 및 안정성 평가
3) 압타머 제제의 in vivo 효능 평가를 위한 대량 합성
4) 간암 진단 목적으로서의 압타머 제제 효용성 평가
5) 간암 치료 목적으로서의 압타머 제제 효용성 평가
시험관증폭선택법 기반 간암 특이 단백질에 특이적으로 결합하는 압타머를 발굴, 최적화하여 혈청 내 안정성이 높은 압타

▣ 연구개발사업의 목표
○ 간암의 진단 도구 및 표적치료제로서 적용 가능한 새로운 압타머 발굴 및 (전)임상 진입 가능한 안정한 압타머 제제 개발
1) 간암 타겟 압타머 발굴
2) 압타머 제제 개발 및 안정성 평가
3) 압타머 제제의 in vivo 효능 평가를 위한 대량 합성
4) 간암 진단 목적으로서의 압타머 제제 효용성 평가
5) 간암 치료 목적으로서의 압타머 제제 효용성 평가
시험관증폭선택법 기반 간암 특이 단백질에 특이적으로 결합하는 압타머를 발굴, 최적화하여 혈청 내 안정성이 높은 압타머를 선별, 개발하고 간암 특이 압타머의 in vitro, in vivo에서의 효능 및 안전성을 검증함. 간암 특이 압타머를 새로운 개념의 표적치료제 및 간암의 비침습적 조기진단의 도구로 개발함.

▣ 연구내용 및 연구방법
[1차년도]
○ 간암 표면 단백질에 특이적으로 높은 결합력을 가지는 압타머 발굴 및 선별
○ 간암 특이 압타머를 간암 세포주에 반응시켜 간암 세포에의 선택적 결합을 확인
○ 압타머 고유의 간암 세포주에 대한 영향을 in vitro 실험을 통해 확인

[2차년도]
○ 압타머의 간암 세포주에의 영향에 관여하는 기전을 밝혀냄
○ 발굴된 압타머를 최적화하고 간암을 억제하는 압타머 선정
○ 선정된 압타머에 기능성 고분자 등을 결합하여 뉴클레아제에 대하여 안정성을 높이면서 간암증식 억제효과를 유지하는 압타머 제제를 합성

[3차년도]
○ 혈청 내에서 안정적으로 유지되는 압타머 제제를 합성하여 in vivo 실험을 통해 생체내에서 압타머 제제 효과를 검증
○ 압타머 제제를 대용량으로 합성하기 위한 프로세스를 확립하고 치료제 스펙에 맞는 분석 QC 확립
○ 임상 평가를 위한 압타머 제제 대용량 합성. 압타머 제제 cGMP 규정에 의한 압타머 제제 QC 분석법 확립. 압타머 제제 impurity profiling

▣ 연구결과
□ 간암 특이 타겟 선별 및 간암 특이 압타머 발굴
○ 간암 및 대조군 혈액 샘플/병리 조직 샘플 수집
- 정상 자원자, 만성 간질환 환자, 간암 환자의 혈액 샘플 및 간암 및 주변부 간 실질 병리 조직을 수집하고 임상정보 수집하여 이를 기반으로 glypican-3 (GPC3)/Melanoma-associated antigen 1 (MAGE-1)을 간암 특이 타겟 막단백으로 선정함. 기수집된 검체를 이용한 clinicopathological study를 통해 간암 조직의 62.3% (250/401)에서 GPC3이, 18.8%(74/394)에서 MAGE1이 발현되며 정상간조직에서는 발현이 안됨을 확인함. 아울러 여러 종류의 암에서 발현이 증가되는 막단백 가운데, 압타머가 개발되어 있는 nucleolin도 대상으로 하기로 함.

○ 간암 타겟 선별 및 압타머 발굴
- 2종의 간암 특이 막단백(GPC3/ MAGE-1)과 특이적으로 결합하는 압타머(GPC3-특이 압타머/MAGE-1-특이 압타머)를 발굴하고, 암 특이 막단백(nucleolin)에 대해 기 개발되어 있는 AS1411을 변형시켜 modified AS1411을 발굴함. 또한 in vitro, in vivo 효능 평가에 필요한 control 압타머를 합성함.

□ 선별된 간암 특이 압타머의 효능 평가 및 작용 기전 규명
○ 선별된 압타머의 in vitro, in vivo 효능 평가 및 간암 억제 작용 기전 규명
- AS1411/modified AS1411 압타머의 in vitro, in vivo 간암 억제 효능을 평가하고 간암 억제 작용기전을 규명함.
- GPC3-특이 압타머 및 MAGE-1-특이 압타머의 in vitro 간암 억제 효능을 평가하고 간암 억제 작용기전을 규명함.

○ 선별된 압타머의 간암 조직에의 선택적 결합성 확인 및 영상용 프로브 제작
- 마우스 생체 내 간암 PET 영상 실험을 통해 선별된 GPC3-특이 압타머의 간암 조직에의 선택적 결합성을 검증하고 영상용 프로브를 제작함.
- GPC3-특이 압타머 제제의 간암 환자 병리 조직 샘플에서 선택적 결합성을 검증함.

□ 선별 압타머 제제의 대량 합성 및 안정성 평가
- 선별된 압타머의 post-SELEX modification을 통해 안정적인 압타머 제제를 개발함.
- 소량의 압타머를 정량적으로 분석 할 수 있는 측정법을 개발하고 검증함.
- 안정적 AS1411/modified AS1411 압타머 제제의 in vivo 효능 검증을 위하여 대량 합성함.
- GPC3 압타머 제제 및 MAGE-1 압타머 제제의 안정성을 평가하고 안정적 압타머 제제를 합성함.

□ 압타머의 최적화: Truncation & PEGylation
- 임상 진입을 위한 최적화 과정으로서 truncated GPC3-특이 압타머 제제를 개발하고 간암 세포에의 선택적 결합 및 in vitro 간암 세포 증식 억제 효과를 검증함.
- 생체 내 안정성 확보를 위하여 truncated GPC3-특이 압타머에 PEGylation을 시행하고 PEGylated GPC3-특이 압타머 제제의 간암 세포 증식 억제 효과를 검증함.

□ 논문 및 특허 출원: 이 연구비를 사사한 논문 총 7편(impact factor 총합=28.321점)을 게재하였고 국제특허 1건과 국내특허 3건을 출원함.

( 출처 : 요약문 5p )

Abstract ▼

▣ Objectives
○ Development of novel aptamers which can be applied as diagnostic tools and targeted therapy modalities for hepatocellular carcinoma and development of stable aptamer preparation for clinical entry
1) Development of aptamers which target hepatocellular carcinoma
2) Development

▣ Objectives
○ Development of novel aptamers which can be applied as diagnostic tools and targeted therapy modalities for hepatocellular carcinoma and development of stable aptamer preparation for clinical entry
1) Development of aptamers which target hepatocellular carcinoma
2) Development of aptamer formulation and evaluation of stability
3) Mass synthesis for evaluating in vivo efficacy of aptamers
4) Evaluation of efficacy of aptamers as diagnostic tools for hepatocellular carcinoma
5) Evaluation of efficacy of aptamers as therapeutic agents for hepatocellular carcinoma

▣ Contents and methods
[1st year]
○ Development of aptamers which have highly specific binding affinity to membrane protein of hepatocellular carcinoma
○ Evaluation of selective binding affinity of aptamers to hepatocellular carcinoma cells
○ Identification of the effect of selected aptamers on hepatocellular carcinoma cells

[2nd year]
○ Identification of mechanism involved in the influence of aptamers on hepatocellular carcinoma cells
○ Optimization and selection of aptamers
○ Synthesis of aptamers that maintain the inhibitory effect of hepatocarcinogenesis while enhancing stability against nuclease by binding functional polymers

[3rd year]
○ Synthesis of aptamer formulation stably maintained in the serum and verification of in vivo efficacy of aptamers
○ Establishment of process to synthesize aptamers in large capacity and analysis QC
○ Mass synthesis of aptamers for clinical evaluation. Establishment of QC method according to cGMP regulation. Impurity profiling of aptamers

▣ Results
□ Selection of targets for hepatocellular carcinoma and development of aptamers
○ Collection of blood/liver tissue samples & selection of targets
- By collecting blood samples, liver tissue samples and clinical information from normal volunteers, patients with chronic liver disease and patients with hepatocellular carcinoma, Clinicopathological study showed hepatocellular carcinoma tissues frequently express glypican-3 (GPC3) (62.3%, 250/401) and melanoma-associated antigen (MAGE-1)(18.8%, 74/394), but normal liver tissues do not. As a result, GPC3 and MAGE-1 were selected as hepatocellular carcinoma-specific target proteins. Among the membrane proteins whose expression is increased in various kinds of cancer, nucleolin, in which aptamer is developed, is also considered.

○ Development of aptamers
- GPC3-specific aptamer/MAGE-1-specific aptamer that specifically bind to glypican-3/MAGE-1 were developed and evaluated. AS 1411, which has already been developed for tagetting nucleolin, was modified. In addition, a control aptamer for in vitro and in vivo study was developed.

□ Evaluation of efficacy of selected aptamers
○ Evaluation of in vitro, in vivo efficacy of selected aptamers and identification of mechanisms of inhibitory effect on hepatocellular carcinoma
- In vitro and in vivo efficacy and mechanism of inhibitory effect on hepatocellular carcinoma of AS1411/modified AS1411 aptamers were identified.
- In vitro efficacy and mechanisms of inhibitory effect on hepatocellular carcinoma of GPC3-specific aptamer/MAGE-1-specific aptamer were evaluated.

○ Verification of selective binding of aptamer to hepatocellular carcinoma tissue and production of image probe
- Image probe using aptamers was produced and selective binding of GPC3-specific aptamer to hepatocellular carcinoma was verified through in vivo PET imaging experiments and in pathologic tissue specimens of patients with hepatocellular carcinoma.

□ Mass synthesis and stability evaluation of selected aptamers
- Stable aptamer formulation was developed through post-SELEX modification.
- Measurement methods that can quantitatively analyze small amounts of aptamers was developed and verified.
- Stable AS1411/modified AS1411 aptamer, GPC3-specific aptamer, MAGE-1-specific aptamer formulations were developed and AS1411/modified AS1411 aptamers were mass synthesized.

□ Optimization of aptamer: Truncation & PEGylation
- Truncated GPC3-specific aptamer was developed as an optimization process for clinical entry, and binding affinity to hepatocellular carcinoma cells and in vitro inhibitory effect on hepatocellular carcinoma cells were evaluated.
- In order to secure the stability in vivo, PEGylated GPC3-specific aptamer was developed and inhibitory effect on hepatocellular carcinoma cells were demonstrated.

□ Publication and patent application
- Seven SCI(E) papers which acknowledged the grant support from this fund were published with a total impact factors of 28.321.
- One international patent and 3 domestic patents were applied.

( 출처 : SUMMARY 7p )

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 2
• 목차 ... 3
• 연구개발사업 최종연구개발결과보고서 요약문 ... 5
• Project Summary ... 7
• 총괄연구과제 연구결과 ... 9
• 1. 총괄연구과제의 최종 연구개발 목표 ... 10
• 2. 총괄연구과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 18
• 3. 총괄연구과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 52
• 4. 총괄연구과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 62
• 5. 총괄연구과제의 활용계획 ... 97
• 6. 첨부서류 ... 100
• 제1세부연구과제 연구결과 ... 111
• 1. 제1세부연구과제의 최종 연구개발 목표 ... 112
• 2. 제1세부연구과제의 연구대상 및 방법 ... 113
• 3. 제1세부연구과제의 최종 연구개발결과 ... 118
• 4. 제1세부연구과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 146
• 5. 제1세부연구과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 151
• 6. 제1세부연구과제의 활용계획 ... 152
• 7. 참고문헌 ... 155
• 제2세부연구과제 연구결과 ... 156
• 1. 제2세부연구과제의 최종 연구개발 목표 ... 157
• 2. 제2세부연구과제의 연구대상 및 방법 ... 163
• 3. 제2세부연구과제의 최종 연구개발결과 ... 170
• 4. 제2세부연구과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 188
• 5. 제2세부연구과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 193
• 6. 제2세부연구과제의 활용계획 ... 194
• 7. 참고문헌 ... 195
• 끝페이지 ... 196