[보고서]아미노아실 tRNA 합성효소 단백질들의 대량 생산 및 결정 구조 연구

황광연

아미노아실 tRNA 합성효소 단백질들의 대량 생산 및 결정 구조 연구 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	고려대학교 산학협력단 Korea University
연구책임자	황광연
참여연구자	조창화 , 이기택 , 김현숙 , 김설희 , 손종현 , 김준수 , 이우철 , 한아름 , 이은혜
보고서유형	2단계보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2015-05
과제시작연도	2014
주관부처	미래창조과학부 Ministry of Science, ICT and Future Planning
등록번호	TRKO201700010052
과제고유번호	1711017033
사업명	글로벌프론티어사업
DB 구축일자	2017-11-13
키워드	단백질구조.질환타겟.단백질-약물 복합체.암.aminoacyl tRNA합성효소.단백질 대량생산.protein structure.therapeutic targets.protein-drug complex.cancer.aminoacyl-tRNA synthetase.protein large-scale production.

초록 ▼

[연구 내용]
1. 아미노아실 tRNA 합성효소 단백질 (ARS) 6종 대량생산 확립
- ProRS 대량생산 벡터 제작 및 정제 과정 확립
- ArgRS 대량생산 벡터 제작 및 정제 과정 확립
- GlnRS 대량생산 벡터 제작 및 정제 과정 확립
- GluRS 대량생산 벡터 제작 및 정제 과정 확립
- CysRS 대량생산 벡터 제작 및 정제 과정 확립
- LeuRS 대량생산 벡터 제작 및 정제 과정 확립

2. ARS 단백질의 5종, 약물복합체 관련구조 6개,MSC 관련 구조 1개 입체구조분석
- ProRS 신규구조규명, 논문 발표 (ActaD, 2013)
- ArgRS 신규구조규명, 논문 발표 (FebS letter, 2014)
- GlnRS 신규구조규명, (2차 기질 결합부위 신규규명)
- ProRS 약물 복합체 구조 4종 규명
- ArgRS 복합체 구조 2종 규명
- LeuRS 박테리아 구조 1개 규명
- MSC 관련 구조 1개 규명 (PNAS, 2014)

( 출처 : 요약서 3p )

Abstract ▼

Aminoacyl-tRNA synthetase (ARS) is an enzyme that catalyzes the esterification of a specific amino acid or its precursor to one of all its compatible cognate tRNAs to form an aminoacyl-tRNA. ARS form multi-synthetase complex with cofactors such as AIMP1(p43), AIMP2 (p38), and AIMP3 (p18). Recently, there are substantial reports regarding that ARS are related to many disease including cancer, neurological disease, and autoimmune diseases.

The aims of this study are to determine three-dimensional structures and characterization of the biochemical properties of single aminoacyl-tRNA synthetases from human (Pro-ARS, Arg-ARS, Cys-ARS, Ile-ARS). The detailed aims are as follows: 1) Overproduction of target proteins (PRS, RRS etc) 2) Structural analysis of the target proteins 3) Complex structure determination and drug design by structure-based.

Using these technologies, we have studied the structure and interaction of the aminoacyl-tRNA synthetases as following.

(1) Overproduction of target ARS proteins
◆ Solublization, purification, vector production for providing the stable proteins
◆ Overproduction stable ARS proteins more than 3 ARSs

(2) Structure determination of ProARS
◆ Solving the Phase problem of ProARS
◆ Complex structure of ProARS

(3) Structure determination of ArgARS
◆ Solving the Phase problem of ArgARS
◆ Complex structure of ArgARS

(4) Stucture-based drug design for ProARS
◆ Complex of ProARS with candidate or lead compounds
◆ Complex of ProARS with HF, FF compounds

(5) Overproduction of MSC proteins
◆ Identifying the binding sites with AIMP1,2,3
◆ Construct with co-expression for MSC proteins

Collectively, this study will provide a foundation for drug development of targeted ARS proteins. Also, the findings of this study will be used in targeting to develop the new drug or candidate compounds.

( 출처 : 영문 요약서 8p )

목차 Contents

표지 ... 1제 출 문 ... 2보고서 요약서 ... 3요약문 ... 4영문 요약서 ... 8CONTENTS ... 9목차 ... 10제1장 연구개발과제의 개요 ... 11제2장 국내외 기술개발 현황 ... 16 (1) 세계적 수준 ... 16 (2) 국내수준 ... 17 (3)국내외의 연구현황 ... 18제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 19제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 42제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 43제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 44제7장 연구시설·장비 현황 ... 44제8장 참고문헌 ... 45끝페이지 ... 46

표/그림 (44)

표 ARS의 3차원 구조적인 특징
표 ARS 표적 신약 개발 현황
표 ARS와 MSC의 생물학적 기전
표 단백질 결정 구조와 NMR 구조 기반한 신약 개발 관련 특허맵 분석
표 ERS (좌), WHEP (중), PRS (우).
표 ERS domain의 Affinity chromatography(좌), Gel filtration chromatography(중), Ion exchange chromatography(우).
표 WHEP domain의 정제 Affinity chromatography(좌), Ion exchange chromatography(중), Gel filtration chromatography(우).
표 PRS의 Affinity chromatography(좌), Ion exchange chromatography (중), Gel filtration chromatography(우).
표 PRS 단백질의 초기 결정 (좌상), 기질인 ATP, 프롤린 과 억제제 Halofuginone (우상), 최적화된 PRS의 결정과 데이터 수집 테이블 (하).
표 Overall Structure 와 Dimer Interface
표 Complex structures (Proline & ATP)
표 Complex structures (Halofuginone)
표 Complex 구조들 사이의 비교분석
표 Complex 구조들의 의미 분석 : 활성 부위들의 차이 분석
표 변이체의 활성 분석
표 Halofuginone의 모식도(좌)와 DWN10271과 DWN10285의 모식도(우). 붉은선으로 표시된 부분이 변형된 부분이다.
표 PRS와 DWN10271의 복합체 구조(A)와 Halofuginone 복합체 구조와의 비교 분석(B), (C). PRS와 DWN10285의 복합체 구조(D)와 Halofuginone 복합체 구조와의 비교 분석(E), (F). Halofuginone은 녹색, DWN10271은 청록색, DWN10285는 자주색으로 각각 표시되었다.
표 PRS의 DWN10271과 DWN10285 근처의 loop 구조. B-factor를 기준으로 색깔을 rainbow spectrum으로 나타내었다.
표 Halofuginone의 2차 변형 억제제인 DWN11251과 DWN10591과의 PRS 복합체 구조.
표 Halofuginone의 3 차 변형억제제인 DWN10620과 PRS 복합체 구조.
표 Data collection and refinement statistics
표 (A) The overall structure of the cytoplasmic free form of hArgRS bound to L-arginine. The Nd, catalytic domain, Ins1,Ins2, and Cd are shown in blue, gray, green, pink, and yellow, respectively. L-arginine is shown in magenta. (B) Magnified views of the substrates in the active site pocket are shown as electrostatic surface models. L-arginine, glycerol, and L-canavanine are shown as magenta, wheat, and yellow stick models, respectively. The chemical structures of L-arginine and L-canavanine are shown above the images. (C, D) Magnified views of the binding sites in hArgRS for L-arginine and glycerol (C), and L-canavanine (D). L-arginine, glycerol, and L-canavanine are colored as described for (B). The residues interacting with the substrates are depicted by stick models and the water molecules are shown as red spheres. Hydrogen bonds are indicated by black dotted lines. The omit map calculated around L-arginine and L-canavanine (shown in cyan and yellow, respectively) represents 2.0 σ. (E) Superimposition of the interactions in the binding sites for L-arginine and L-canavanine in hArgRS. L-arginine and L-canavanine are colored as described for (B). Interactions between hArgRS and L-arginine or L-canavanine are indicated as gray or dark gray stick models, respectively.
표 (A–C) Structural comparisons of the apo (A), L-canavanine-complexed (B), and L-arginine-complexed (C) forms of hArgRS shown as electrostatic surface models. The residues that form hydrogen bonds are indicated by stick models and water molecules are shown as red spheres. Hydrogen bonds are indicated by black dotted lines. The active site pocket for the substrate and the cavity for binding of the tRNAArg acceptor arm are r epresented by yellow and green dotted circles, respectively. (D) A structural superimposition of the apo (cyan), L-canavanine-complexed (pink), and L-arginine-complexed (gray) forms of hArgRS. Each structure is shown as a ribbon model. The large and small boxed areas, which are markedly different regions, indicate those shown in (A–C) and (E), respectively. The disordered regions are indicated by dotted lines. (E) Comparisons of residues in the active sites. The shifted residues are shown as stick models, which are colored as in (D). The directions of their shift are indicated by arrows.
표 Data collection and refinement statistics
표 Crystals of hGlnRS
표 Modelling of human Glutaminyl-tRNA synthetase bound to tRNAGln
표 현재 단백질의 정제 과정 요약. 위쪽은 UV 스펙트럼, 아래쪽은 SDS-PAGE 결과.
표 RRS와 AIMP1 복합체의 미세 결정.
표 AIMP2의 정제 과정 요약. 위쪽은 UV 스펙트럼, 아래쪽은 SDS-PAGE 결과.
표 AIMP2와 DRS 복합체의 정제 과정 요약. 위쪽은 UV 스펙트럼, 아래쪽은 SDS-PAGE 결과.
표 AIMP2와 ERS의 정제 과정 요약. 위쪽은 UV 스펙트럼, 아래쪽은 SDS-PAGE 결과.
표 AIMP2와 ERS 및 DRS 복합체의 정제 과정 요약. 위쪽은 UV 스펙트럼, 아래쪽은 SDS-PAGE 결과.
표 AIMP2와 ERS, MRS 및 AIMP3 복합체의 정제 과정 요약. 위쪽은 UV 스펙트럼, 아래쪽은 SDS-PAGE 결과.
표 AIMP2와 ERS, DRS, MRS 및 AIMP3 복합체의 정제 과정 요약. 위쪽은 UV 스펙트럼, 아래쪽은 SDS-PAGE 결과.
표 IRS editing domain 의 과발현 및 수용성 테스트 결과.
표 (좌) Thermus thermophilus IleRS 단백질의 구조 (우) Thermus thermophilus IleRS editing domain과 Human IRS 간의 아미노산 서열 비교
표 Affinity chromatography(좌) 와 Gel filtration(우) 정제 결과.
표 IRS 와 AIMP2 단백질의 클로닝 및 과발현 테스트 결과.
표 IRS editing 도메인과 AIMP2 단백질 및 ERS, WHEP 단백질의 과발현 테스트 결과.
표 AIMP2_48S 정제 결과 그림.
표 AIMP2_48S 단백질의 결정 스크리닝 결과.
표 현재 단백질의 정제 과정 요약. 위쪽은 UV 스펙트럼, 아래쪽은 SDS-PAGE 결과.
표 Tt Leu-ARS 결정. 결정조건은 1M Potassium sodium tartrate, pH 8.0, 0.1M imidazole 0.2 M NaCl 임.
표 현재 단백질의 정제 과정 요약. 위쪽은 UV 스펙트럼, 아래쪽은 SDS-PAGE 결과.

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과제기간(DetailSeriesProject) :	-
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