[보고서]광역학 치료 및 진단 겸용 신규 광감작제의 개발

심영기

광역학 치료 및 진단 겸용 신규 광감작제의 개발
Development of new photosensitizers for dual function of photodynamic therapy and diagnosis 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	인제대학교 산학협력단 Inje University
연구책임자	심영기
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2015-12
과제시작연도	2015
주관부처	미래창조과학부 Ministry of Science, ICT and Future Planning
등록번호	TRKO201700010558
과제고유번호	1345234011
사업명	이공학개인기초연구지원
DB 구축일자	2017-10-12
키워드	광역학치료.광역학진단.광역학물질.종양선택성.비침투성.레이저.클로린.퍼퓨린이마이드.나노입자.photodynamic therapy.photodynamic diagnosis.photosensitizers.tumor selectivity.non-invasive.lasers.chlorins.purpurinimides.nano-particles.
DOI	https://doi.org/10.23000/TRKO201700010558

초록 ▼

연구의 목적 및 내용
차세대 난치성 질환 치료 및 진단은 환자 중심의 맞춤형과 비침투성 기술이 대세를 이룰 것이다. 특히 암 세포와 같은 비 정상적인 세포에 선택적으로 축적되어 적당한 빛에너지에 의해 활성화되는 광역학물질(PS)은 이러한 차세대 질병의 진단과 치료에 가장 적절한 것으로 많은 연구자들의 관심을 끌고 있다. 지금까지의 광역학물질의 개발은 주로 치료중심의 물질 개발에 초점이 맞추어져 있었으며, 진단용은 별도로 연구가 되어 왔다. 본 연구에서는 체내 침투가 상대적으로 깊으면서 종양 선택성이 뛰어날 뿐만 아니라 형광내시경에 민감하여 작은 크기의 종양도 구별해 낼 수 있는 진단과 치료가 가능한 광역학물질의 후보물질을 개발하였다.

연구결과
클로로필-a 반죽으로부터 메틸페오포비드-a를 대량 추출하여 클로린 및 퍼퓨린이마이드 유도체들을 합성하였으며 다수의 >700 nm의 장파장 영역의 흡수를 갖고 광 세포독성이 우수한 새로운 PS를 개발하였다. 또한 클로린 및 퍼퓨린이마이드 유도체들의 물에 대한 용해도 문제를 해결하기 위해 ionic liquid(IL) 형태의 PS를 개발하였다. 클로린 및 퍼퓨린이마이드 유도체와 IL을 이용한 금 나노입자(GNPs)를 제조하였으며 금속 나노입자의 장점을 살린 PDT 효능이 향상된 우수한 결과를 얻었다. 양이온성 클로린 및 퍼퓨린이마이드와 다중 음이온성 폴리옥소메탈레이트(POM)를 정전기적 인력으로 결합시킨 초분자 착물을 제조하여 효과적으로 PS를 운반시킴으로써 향상된 치료효능을 얻었다. 금 나노막대(GNR)을 이용한 layer-by-layer 방법으로 GNR-PS 착물을 제조하여 808 nm 레이저와 640~710 nm LED를 사용한 광열적치료(PTT)와 PDT가 혼합된 이중 치료로 치료효과를 극대화시킨 결과를 얻었다. 약효활성 실험은 A549(폐암) 또는 HeLa(자궁암) 세포 등을 이용한 세포내(in vitro) 실험을 수행하였으며 쥐를 이용한 생체내(in vivo) 실험을 수행하고 있다. 이러한 연구결과는 클로린 및 퍼퓨린이마이드계 유도체들은 자체 형광방출로 인해 이들의 금속 나노입자 복합체로서 형광내시경 또는 MRI/CT용 암 진단/치료 겸용 광역학물질 개발에 적용이 가능하다.

연구결과의 활용계획
광역학 물질의 높은 암세포 선택성으로 난치병인 각종 암의 치료와 조기 진단용으로 활용될 수 있다. 빛의 장파장 흡수로 암조직에 대한 침투깊이 증가, IL을 이용한 물에 대한 용해도 향상, GNPs와 POM을 활용한 광역학 물질의 효율적인 운반과 약물의 암(dark) 독성 문제 해결, GNR을 이용한 PTT/PDT 혼합 이중 시너지 치료 효과로 인해 PDT/PTT를 이용한 진단/치료 겸용 임상 시스템에 적용이 가능하다.

그 외에도 AIDS virus 및 신생 혈관생성으로 인한 노인성황변(AMD) 치료, 박테리아를 처치하여 전신감염이나 항생제 내성 세균(MRSA) 치료 등에도 활용할 수 있다. 광역학물질의 금속 나노입자 복합체는 형광내시경 또는 MRI/CT/PET 등의 기술과 결합시켜 다양한 질병의 조기 진단에도 활용할 수가 있다. 광역학물질의 갈락토스 복합체는 종양표시자(cancer marker)인 갈렉틴(Galectin)과의 친화성이 높아 최소량 혈액만으로도 암을 조기진단할 수 있는 바이오센서 개발에도 응용할 수가 있다.

(출처 : 한글요약문 5p)

Abstract ▼

Purpose&contents
The photodynamic therapy and diagnosis (PDT/PDD) which is the typical non-invasive and custom-ordered therapy will be the major technology for cancer treatment and diagnosis in coming ages. The photosensitizers (PSs) which have key roles in PDT/PDD are very much attractive to many researchers due to their high accumulation ratio to tumors and being activated by no-harmful UV/Vis light.

Unfortunately most of researches in this field are limited to therapeutic application and diagnostic application separately. We are focusing on dual function of PSs to therapy and diagnosis simultaneously. Now we propose the synthesis of new candidate compounds having long-wavelength and metal complex and effective activities with deeper penetration and higher cancer cell selectivities. When we use fluorescence endoscopes with these compounds, even smaller cancer cells can be detected easily. We generated new candidate of PS derivatives of dual function of therapy and diagnosis.

Result
Chlorin and purpurinimide derivatives were synthesized from methylpheophorbide-a which was extracted from chlorophyll-a paste. We developed a few number of new PSs those have >700 nm long wavelength absorption and excellent photoactivity.

Ionic liquid(IL) type PS were developed for low solubility problem of the PSs.
Furthermore, gold nanoparticles(GNPs) with new chlorin and purpurinimide derivatives as well as IL type PS were generated to show enhanced PDT effect based on advantages of the metal nanoparticles. Supramolecular complex, using cationic chlorins or purpurinimides and polyanionic polyoxometalate (POM) through electrostatic interactions, were prepared to present high PDT activity result. Dual combined therapy contains photothermal therapy(PTT) and PDT reveals significantly enhanced photoactivity result by using gold nanorod(GNR) through layer-by-layer method to give GNR-PS complex with irradiation of 808 nm laser and 640~710 nm LED. The activity test was carried out through in vitro using A549 and HeLa cells, and in vivo test is in progress. These results can be applied for development of PS for PDT/PDD dual function by using metal nanoparticle complexes of the chlorins and purpurinimides those showed fluorescence emission which is applied in fluorescence endoscope or MRI/CT.

Expected Contribution
The high tumor cell selectivity can be applied for early diagnosis and therapy of cancers. Based on the increase of depth of penetration into cancer tissue by using long wavelength absorption, enhancement of water solubility by using IL, suitable PS delivery vehicle using GNPs and POM, PTT/PDT dual combined synergistic therapy using GNR, it is possible to apply in PDD/PDT dual clinic system. In addition, this system can be applied to AIDS virus, retrovirus, engiogenesis and bacteria, AMD (Age-related Macular Degeneration) and microbial diseases (MRSA). The complexes of metal nanoparticles of PSs will be used to detect small cancer cells by fluorescence endoscopes or MRI/CT/PET. Galactose derivatives of the PSs will bu used a high sensitive binding affinity to Galectin (cancer marker) to contribute to biosensor developments.

(출처 : SUMMARY 6p)

목차 Contents

표지 ... 1목차 ... 3연구 계획 요약문 ... 4연구 결과 요약문 ... 5 한글요약문 ... 5 SUMMARY ... 6연구내용 및 결과 ... 7 1. 연구개발과제의 개요 ... 7 2. 국내외 기술개발 현황 ... 10 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 11 4. 목표 달성도 및 관련 분야에의 기여도 ... 42 5. 연구결과의 활용계획 ... 44 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 46 7. 주관연구책임자 대표적 연구 실적 ... 48 8. 참고 문헌 ... 48 9. 연구 성과 ... 52 10. 기타사항 ... 60대표연구성과 ... 61끝페이지 ... 65

표/그림 (40)

표 Reaction mechanisms of Type Ⅰ and II of PDT
표 Treatment of PDT into the body of patient
표 Chemical structures of (a) PhotofrinⓇ, (b) chlorin and (c)bacteriochlorin derivatives.
표 Chemical modification of MPa for the synthesis of chlorin and purpurinimide derivatives.
표 Cell viability study using MTT or WST-1 assay in vitro
표 The comparative `HMNR spectra(CD-CL₃ 500MHz) in the region
표 Electronic abserption spectra(10 pM in Ch₂Cl₂) of 3²-substituted MPP2(A), and 3²- substituted purpurinimide(B)
표 Absorption prperties of 3²- substituted cholfins in Ch₂Cl₂
표 Cell viability results in dark and after PDT in HeLa cells for MPPa-based cationic chlorins
표 IC₅₀ values of photosensitizers in HeLa cells
표 1H-NMR spectrum of Pu-18-NMGA 3 (500 MHz, CD3OD, 298K)
표 1H-NMR spectrum of PS–GNPs conjugate 4 (500 MHz, CD3OD, 298K)
표 UV-vis spectra of a) PS 3 and b) PS–GNPs conjugate 4 c) the citrate–GNPs 5 in water
표 TEM images of the PS–GNPs conjugate 4 (a,b), the citrate–GNPs 5 (c,d)
표 XRD pattern of the PS–GNPs conjugate 4
표 IR spectra of a) NMGA and b) PS–GNPs conjugate 4
표 TGA profiles of the PS–GNPs conjugate 4
표 LD50 values of Pu-18-NMGA 3 (PS) and the PS–GNPs conjugate 4 (PS–GNPs) in A549 cells. LD50 values was determined by MTT assay at 3h, 24h, and 48h incubation after photo irradation
표 Cell viability (%) of Pu-18-NMGA 3 (PS), PS–GNPs conjugate 4 (PS–GNPs), and citrate–GNPs 5 (GNPs) (5.5 μg/ml concentration of PS) treated A549 cells by exposure GtoN Pasn) ,i rarnaddi actiitorna tea–t670–710 nm (2 J·cm−2) for 15 min.
표 UV-vis spectra of PS1 and PS-GNPs conjugates 2a–2e with various molar ratios between gold and Pu-18-NMGA in water (2a, Au:Pu-18-NMGA = 1 : 2; 2b, 1 : 4; 2c, 1 : 6; 2d, 1 : 8; 2e,1 : 10).
표 TEM images of the PS-GNPs conjugates 2a–2e. The scale bars are 50 nm and the inset scale bars are 10 nm.
표 Summary of TEM images of the PS–GNPs conjugates 2a–2e.
표 Comparative cell viability (%) of PS1 (3.2 g/mL) and the PS-GNPs conjugates 2a–2e against A549 cells by photo irradiation (670–710 nm, total light dose 2 J cm–2, irradiation time 15 min)at 3 h, 24 h, and 48 h incubation times.
표 IC50 (μg/ml) values of PS1 and 2a–2e against A549 cells at various incubation times. IC50 values were determined by MTT assay at 3 h, 24 h and 48 h incubation after photo irradiation.
표 Cell viability of photocytotoxicity and dark cytotoxicity of the chlorin 3, POM 4 and the chlorin–POM complex 5 against A549 cells at a concentration range (0.5–20 μM) and a light dose (2 Jcm–2).
표 Absorbance decay (%) of DPBF (50 mM in DMSO) at 418 nm after photo irradiation (total light dose 2 J cm–2, irradiation time 15 min) in the absence (control) and presence of 1 mM of MB (methyleneblue), chlorin 3, POM 4, and chlorin–POM complex 5.
표 Confocal laser scanning images of A549 cells. a–c) Complex 5 before irradiation, d–f)complex 5 after irradiation of 640–710 nm for 20 min at 2 Jcm–2, g–i)chlorin3 before irradiation, j–l) chlorin 3 after irradiation. a,d,g,j) Chlorins (red) in 3 or 5. b,e,h,k) Nuclear dye DAPI (blue). c,f,i,l) Merged.
표 Synthetic method of IL1-PS-GNPs~IL4-PS-GNPs with various IL type PS(IL1-PS~IL4-PS)
표 TEM images of IL1-PS-GNPs~IL4-PS-GNPs
표 Photodynamic activity result of IL1-PS and IL1-PS-GNPs using MTT assay against A549 cell lines
표 Confocal laser scanning images of merged color for IL1-PS, IL1-PS-GNPs, IL3-PS, and IL3-PS-GNPs against A549 cells at 12 h incubation time.
표 LIV -vis absorption spectra in the preparation of the GNR-PS complex by LbL methed.
표 (a)TEM image of GNR-CTAB and (b)UV-vis spectrum of GNR-CTAB
표 Cell viability of photocytotoxicity of the PS and the complex against A549 cells at a concentration range of 1-20 uM and two light doses of 120J cm-2 for PTT and 2 J cm-2 fof PDT.
표 LIV-vis absarbance decay(%) of DPSF (50mM in DMSO) for the GNR-PS complex at 420 nm after photoirradiation
표 IC50 values of the purpurinimides aainst A549 cell lines at 12 h incubation timeafter photoirradiation.
표 Comparative absorbance decay (%) of DPBF (50 mM in DMSO) at 418 nm after photoirradiation (total light dose 2 J cm–2, irradiation time 15 min) in the absence (control) and presence of 1 mM of MB (methylene blue), 4a–4c and 7a–7c. The data are expressed as mean of three experiments.
표 Comparative UV-Vis spectra between the GNPs and free IL-PS
표 Confocal laser scanning images of Click, Click-MeI, and Click-MeI-POM against A549 cells without light for nuclear dye DAPI (blue), PS (red), and merged (purple). And optical images of A549 cells after light irradiation for morphological change
표 Cell viability study of Click, Click-MeI, and Click-MeI-POM at 1~20 μM and 3 h incubation time against A549 cell lines (total light dose 2 J cm–2, irradiation time 15 min)

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