초록 ▼

건강 기능성 소재인 GABA를 다양하게 활용하기 위해서는 고 농도로 GABA를 생산하는 균주들 개발과 경제적이고 간편한 생산방법 개발이 필수적이며 특히 배지에 MSG나 glutamic acid 첨가가 필요 없는 생산방법 개발이 중요하다. 이를 위해 GABA 고생산 유산균들과 glutamic acid 생산 유산균들 탐색하여 공동배양을 통해 해결 방안을 찾고자 하였으며, 동시에 MSG를 대체할 수 있는 물질들을 탐색하고 이를 활용한 GABA 생산을 확인하고자 하였다. 또한 gad 유전자 클로닝 및 외래숙주들에서 발현을 확인하였다.

건강 기능성 소재인 GABA를 다양하게 활용하기 위해서는 고 농도로 GABA를 생산하는 균주들 개발과 경제적이고 간편한 생산방법 개발이 필수적이며 특히 배지에 MSG나 glutamic acid 첨가가 필요 없는 생산방법 개발이 중요하다. 이를 위해 GABA 고생산 유산균들과 glutamic acid 생산 유산균들 탐색하여 공동배양을 통해 해결 방안을 찾고자 하였으며, 동시에 MSG를 대체할 수 있는 물질들을 탐색하고 이를 활용한 GABA 생산을 확인하고자 하였다. 또한 gad 유전자 클로닝 및 외래숙주들에서 발현을 확인하였다.
연구 기간 3년 동안 계속적으로 김치, 젓갈 등 다양한 발효 식품들로부터 GABA 고 생성 유산균주와 glutamic acid 생성 유산균주들을 선별하였다. 약 7-8천여종의 분리 유산균주들을 TLC 방법을 통하여 1차적으로 선별하였고 GABase를 이용한 정량 분석을 통하여 최종적으로 우수한 균주들을 선별하였다. GABA 생성 유산균주로 Lactobacillus sakei A156과 Enterococcus avium M5를 포함한 5 균주들을 선발하고 이들 중 두 균주에 대해 상세한 연구를 수행하였다. Lb. sakei A156는 20-45℃, pH 4.0-8.0, 그리고 식염농도 7.0% 이하에서 잘 생육하였다. Glutamate decarboxylase 효소 특성 조사를 위하여 A156 gadB 유전자를 대장균 발현 벡터인 pET26b(+)에 클로닝한 후, E. coli BL21(DE3)에 도입하여 과발현시켰다. 생성된 54 kDa 단백질은 Ni⁺²-nitrilotriacetic acid resin을 사용한 affinity chromatography에 의해 정제하였다. GAD 활성에 최적인 온도는 55℃이며, 최적 pH는 4.5로 나타났다. 또한 GAD 활성은 MnCl₂ (152%), CoCl₂ (118%), ZnCl₂ (115%). CaCl₂ (113%) 첨가에 의해 증가하지만 AgNO₃ (79%), MgCl₂ (84%), (NH₄)₂SO₄ (92%) 첨가에서는 다소 감소하였다. E. avium M5 균주의 GAD에 관한 연구도 동일한 방법으로 수행하였으며, Enterococcus 속의 GABA 생성과 관련된 연구는 현재까지 거의 보고되지 않았다. 외래 숙주에서 gadB gene 발현을 위하여 유산균용 벡터 (pMG36e, pSJE, pJY33E) 및 바실러스용 벡터(pHY300PLK)를 이용하여 유산균과 바실러스들에 도입한 결과 해당 유전자의 발현을 확인하였다. 선별된 glutamic acid 생성 6 종 유산균들 중 Lb. sakei KG27의 생성능이 가장 높았으며, 이 균주와 Lb. sakei A156와 공동배양을 시도하였다. MRS broth에 두 균주를 2:3으로 공동 배양 시 GABA 양은 1.17 mg/ml으로 이는 Lb. sakei A156 균주 단독 배양시의 1.106 mg/ml과 비교하여 약간 증가했지만 큰 차이는 없었다. 미강, 다시마 등의 소재들을 MSG 대체제로 이용 가능성을 조사하였다. 건조 다시마를 열수 추출한 후, 감압농축 및 동결 건조를 통하여 농축한 다시마 농축물을 MRS 배지에 농도별 (1, 5, 10%)로 첨가하여 Lb. sakei A156 균주를 배양하였다. 그 결과, 각각 2.79±0.24mg/ml, 10.62±0.48mg/ml, 그리고 14.86±0.79 mg/ml GABA를 생성하였다. MSG를 첨가하였을 때 생성된 GABA 8.44±0.28mg/ml (1%), 17.99±0.49mg/ml (3%) 수율과 비교시 4-5%의 다시마 농축물이 MSG 1%와 비슷한 효과를 내었다.
분리 유산균주들 중에서 probiotic으로 활용 가능한 균주들을 탐색한 결과 Pediococcus pentosus 3 균주가 우수함을 확인하였다. 이들에 대해 pH 3에서 2 시간 출 후 생육도를 조사한 결과 F66 균주는 32.6% 생존율을 그리고 D56은 17.2%, A24는 7.5% 생존율을 보였다. 이들 균주에 대해 식염농도별 생육과 항생제들에 대한 민감성, 및 Caco-2 세포주 흡착능력을 조사한 결과 probiotic 으로 적합함을 확인하였다. 장기적으로 probiotic 균주에 GABA 생산능을 부여할 목적으로 기초연구를 수행하였다. GABA 유전자를 전달하기 위한 도구로 발현벡터 개발에 관한 연구도 수행하였다. Weissella cibaria 33 균주는 2365 bp 의 작은 cryptic plasmid인 pJY33을 지니고 있음이 확인되어 이를 벡터의 frame 으로 활용하고자 하였다. pJY33에 대장균 벡터인 pBluescript II SK(-)와 erythromycin resistance gene을 연결시켜 6.5 kb 대장균-유산균 shuttle vector인 pJY33E를 얻었다. pJY33E는 Lactococcus lactis, Leuconostoc citreum, Lactobacillus brevis, Weissella confusa 에서 성공적으로 복제되었다. 발현벡터로서의 효율성 검증을 위하여 Leuconostoc mesenteroides 유래 alpha-galactosidase 유전자 (aga)를 pJY33E에 클로닝한 후 Lb. brevis 2.14에 도입한 결과 재조합체에서 aga 유전자 발현이 확인되었다. 재조합체를 melibiose 함유 배지에서 배양할 경우 alpha-Gal 역가는 최고인 36.13 u/mg protein 에 달했다. 이상결과에서 추후 pJTY33E를 이용하여 gad 유전자를 유산균에 도입시킨 재조합체를 얻고 재조합체들에서 GABA 생성을 조사할 예정이다. 궁극적인 목표는 유전자 조작을 통해 식품발효를 통해 안전하면서도 고효율로 GABA를 생성하는 균주를 얻어 발효식품의 종균으로 그리고 Probiotics로 활용하는 것이다.

(출처 : 연구결과 요약문 3p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 목차 ... 2
• Ⅰ. 연구결과 요약문 ... 3
• Ⅱ. 연구내용 및 결과 ... 4
• 1. 연구과제의 개요 ... 4
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 4
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 4
• 4. 목표 달성도 및 관련 분야에의 기여도 ... 8
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 8
• 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 8
• Ⅲ. 연구성과 ... 9
• 끝페이지 ... 10