초록 ▼

MCL-PHA를 분해하는 미생물들의 생태학적 다양성을 조사하기 위해서, 분해능이 우수한 다수의 박테리아 균주들을 다양한 환경으로부터 분리하였으며, 16S rDNA 염기서열 분석을 통하여 동정하였다. 그 결과, Pseudomonas, Streptomyces, 그리고 Janthinobacterium 속에 포함되는 균주들이 주된 MCL-PHA 분해미생물임이 확인되었다. 분리균주의 속에 따라 phaZ 유전자를 효과적으로 분리하기 위하여 제조된 PCR primer pair를 이용하여 균주간 다양성을 비교하였으며, 이 중 Variovorax

MCL-PHA를 분해하는 미생물들의 생태학적 다양성을 조사하기 위해서, 분해능이 우수한 다수의 박테리아 균주들을 다양한 환경으로부터 분리하였으며, 16S rDNA 염기서열 분석을 통하여 동정하였다. 그 결과, Pseudomonas, Streptomyces, 그리고 Janthinobacterium 속에 포함되는 균주들이 주된 MCL-PHA 분해미생물임이 확인되었다. 분리균주의 속에 따라 phaZ 유전자를 효과적으로 분리하기 위하여 제조된 PCR primer pair를 이용하여 균주간 다양성을 비교하였으며, 이 중 Variovorax sp. DSH-2, Pseudomonas aestusnigri M13-3 및 Streptomyces venezuelae S-7 균주에 대한 전체 phaZ 유전자를 클로닝하여 분석하였다. 이들의 PhaZ는 278-291개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 기존에 알려진 PhaZ와 상대적으로 낮은 상동성을 나타내었다. 그러나 N-말단에 substrate-binding domain, C-말단에 catalytic domain이 존재하였으며, catalytic domain에는 lipase box(Gly-Ile-Ser-Ser-Gly)와 catalytic triad(Ser-Asp-His) 및 oxyanion hole 아미노산을 공통적으로 보유하고 있음을 확인하였다. 또한 본 연구에서는 3가지 분리균주 (Variovorax sp. DSH-1, Variovorax sp. DSH-2, Pseudomonas aestusnigri M13-3)를 선정하여 이들의 PhaZ 효소를 정제하고 그 특성을 조사하였다. 이 중 Variovorax sp. DSH-2와 P. aestusnigri M13-3 균주의 PhaZ는 몇 가지 생화학적 특성 및 효소저해제에 대한 민감성의 차이면에서 기존의 효소와 구별되는 특징을 보였다. 한편, 두 종류의 MCL-PHAs [PHN과 PHDD(=)]를 이용하여 이들의 생분해 거동을 자연환경(토양)과 인공환경(실험실)조건에서 조사하였다. 토양에서의 매립 497일이 지난 후, PHN과 PHDD(=) 필름의 무게는 각각 2.15% 및 6.91%감소하였다. 또, 실험실 환경에서의 PHN과 PHDD(=) 필름은 160일 후 각각 18.9% 및 66.0%의 무게감소를 보임으로써, 생분해가 보다 더 활발하게 일어났다. 그러나 이러한 생분해도는 같은 조건에서 조사된 PHBV(short-chain-length PHA)의 무게감소 94.3%에 비하여 매우 낮음을 확인하였다. 분해과정 중 MCL-PHA 필름의 표면 변화를 SEM을 이용하여 분석하였으며, X-ray 회절분석은 고분자의 결정성 (amorphous 혹은 crystalline)이 분해도에 영향을 끼치는 중요한 요인임을 보여주었다. MCL-PHAs의 분해 과정 중 Streptomyces와 Pseudomonas 속의 균주가 우점종으로 나타났으며, 이들의 개체수는 전체 MCL-PHAs 분해 미생물의 56% 및 34%를 차지하였다.
(출처: 연구결과 요약문 4p)

Abstract ▼

To investigate the phylogenetic diversity of MCL-PHA-degrading microorganisms, several bacterial strains capable of degrading MCL-PHA were selectively isolated from various environments and identified based on the results of 16S rDNA analysis. Among them, Pseudomonas, Streptomyces, and Janthinobact

To investigate the phylogenetic diversity of MCL-PHA-degrading microorganisms, several bacterial strains capable of degrading MCL-PHA were selectively isolated from various environments and identified based on the results of 16S rDNA analysis. Among them, Pseudomonas, Streptomyces, and Janthinobacterium strains were found to be prodominantly responsible for the biodegradation of MCL-PHA. For the efficient cloning of phaZ gene from the isolates, two PCR primer pairs for Pseudomonas (along with Janthinobacterium) and Streptomyces strains, respectively, were designed. The phaZ genes from Streptomyces strains showed high nucleotide sequence identities exceeding 99% with each other. On the contrary, sequence similarities of phaZ genes between Pseudomonas strains were less 90%. Extracellular MCL-PHA depolymerases (PhaZ) from three isolates (variovorax sp. DSH-1, Variovorax sp. DSH-2 and Pseudomonas aestusnigri M13-3) were individually purified to electrophoretic homogeneity and characterized. The purified enzymes coild not hydrolyze polyhydroxybutyrate, poly(L-lactide)and polycaprolactone, but it could hydrolyze various p-nitrophenylalkanoates (PNP-alkanoates). Although the MCL-PHA depolymerases are believed to be the esterase belonging to the serine hydrolase family, the present results suggest that they are distinct enzymes, which are different from those of other MCL-PHA degrading bacteria in their biochemical properties to enzyme inhibitors. The phaZ genes of Variovorax sp. DSH-1, Streptomyces venezuelae S-7 and Pseudomonas aestusnigri M13-3, were also cloned and analyzed. The genes contained 837-876 bp ORF, with deduced proteins of 278-291 amino acids. The amino acids sequence of the PhaZ showed relatively iow identity (94%) with those of other Pseudomonas MCL-PHA depolymerases. Amino acid sequence analyses showed that a substrate-binding domain and a catalytic domain are located in the N-terminus and in the C-terminus, respectively. The enzyme contains the lipase box (Gly-Ile-Ser-Ser-Gly) and catalytic triad (Ser-Asp-His)in ots catalytic domain, and utilizes Asn as an oxyanion hole amino acid. Studies of MCL-PHAs biodegradation in natural (soil) and controlled (laboratory) environments. After 497 days of bury in soil, the weight of PHN and PHDD(=) films in soil decreased by 2.15% and 6.91%, respectively, of the initial value. Biodegradation rates of polymer films in laboratory condition were found to be higher than those of soil specimens. The weight loss of MCL-PHA films in the laboratory condition after 160 days of incubation was 18.9% for PHN and 66.0% for PHDD(=). However, these biodegradation rates were lower than that (94.3%) of PHBV film (a short-chain-length PHA) measured under the same condition. The surface aspect of the MCL-PHA film suggests their degradation via a surface erosion mechanism. X-ray diffraction analysis revealed that the physical state of the polymers (amorphous or crystalline) is one of the important factors infuencing their degradation rates. Among the microorganisms involved in the degradation of MCL-PHAs, Streptomyces and Pseudomonas strains were predominant and accounted for approximately 56% and 34% of the total isolates, respectively.
(출처: Summary 5p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 목차 ... 2
• 연구계획 요약문 ... 3
• 연구결과 요약문 ... 4
• 한글요약문 ... 4
• SUMMARY ... 5
• 연구내용 및 결과 ... 6
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 6
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 7
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 7
• 4. 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 36
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 37
• 6. 연구과정에서 수집한 해외 과학기술정보 ... 38
• 7. 참고문헌 ... 38
• 8. 연구성과 ... 40
• 9. 국가과학기술지식정보 서비스에 등록한 연구시설·장비 현황 ... 40
• 10. 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전조치 이행실적 ... 40
• 11. 기타사항 ... 42
• 끝페이지 ... 42