초록 ▼

본 연구에서 곤충세포 형질전환 자궁경부암 백신 16형, 18형 정제 항원을 확보하였으며 확보한 정제항원을 이용하여 분석 물질을 신속하고 정확하게 분석 할 수 있어 널리 쓰이고 있는 HPLC 분석법을 개발하였다. 먼저 물질의 크기에 따라 검출하는 Size exclusion chromatography(SEC-HPLC)법과 Heparin affinity chromatography(Heparin-HPLC) 분석법 그리고 VLP를 L1 peptide 단위로 잘라서 분석하는 Reverse phase chromatography(RP-HPLC)법

본 연구에서 곤충세포 형질전환 자궁경부암 백신 16형, 18형 정제 항원을 확보하였으며 확보한 정제항원을 이용하여 분석 물질을 신속하고 정확하게 분석 할 수 있어 널리 쓰이고 있는 HPLC 분석법을 개발하였다. 먼저 물질의 크기에 따라 검출하는 Size exclusion chromatography(SEC-HPLC)법과 Heparin affinity chromatography(Heparin-HPLC) 분석법 그리고 VLP를 L1 peptide 단위로 잘라서 분석하는 Reverse phase chromatography(RP-HPLC)법을 이용하여 VLP 함량 시험법을 개발하였고 해당 시험법의 밸리데이션을 수행하였다. (특이성, 직선성, 정확성, 정밀성, 정량한계) 그 결과 각각 3일간 함량측정결과의 RSD 값이 16형의 경우, SEC-HPLC 2.9%이하, Heparin-HPLC 3.4%이하, RP-HPLC 5.8%이하로 나타났고, 18형의 경우, Heparin-HPLC 6.9%이하, RP-HPLC 6.9% 이하로 나타났다. 확립된 시험법은 모두 직선성의 r² 값이 0.99이상으로 세 시험법 모두 VLP 함량측정법으로 적합함을 확인할 수 있었다. 하지만 SEC-HPLC 시험법의 경우, 다른 시험법에 비해 시간이 오래 걸리고 컬럼의 압력이 과도하게 올라가는 문제점이 있어서 SEC-HPLC 시험법을 제외하고 다른 두 가지 시험법을 선정하여 관련 제조업체와 공동연구를 수행하여 시험기관간 시험결과의 유효성을 확인하였다. 확립된 시험법을 생산공정중 품질관리시험법으로 활용할 수 있을지를 확인하기 위해 HPV 16형·18형 중간산물(1차 중간산물, 2차 중간산물)을 확보하여 개발된 2가지 시험법을 적용하였다.

Heparin-HPLC 시험법에서는 VLP 농도가 낮은 중간산물에서는 검출한계와 비슷한 정도로 분석 감도가 낮아 중간산물에서 VLP 함량 측정 시험법으로 사용하기 어려웠다. RP-HPLC 시험법으로 시험한 결과, 16형 1차·2차 중간산물에서는 각각 0.05, 0.02 ug/ul, 18형 1차·2차 중간산물에서는 각각 0.11,0.09 ug/ul의 VLP 함량이 계산되었다. 함량측정결과의 신뢰성을 확인하고자 Western blot 실험을 통해 band intensity를 비교함으로써 중간산물의 VLP 함량을 증명하였다. 최종 확립된 시험법을 바탕으로 표준작업지침서(SOP)를 개발하였다. 확립된 시험법은 HPV VLP 생산 공정중관리 중 품질관리 시험법으로 활용할 수 있을 것으로 기대되며, 자궁경부암백신 자급화 지원에 활용할 수 있을것으로 기대한다.

( 출처 : 요약문 3p )

Abstract ▼

In this research, we developed quantification testing method based on the rapid and accurate HPLC assay. For this study, purified HPV 16, 18 VLPs from insect cell transformationn were secured. We applied size exclusion chromatography, in which molecules in solution are separated by their size, Rever

In this research, we developed quantification testing method based on the rapid and accurate HPLC assay. For this study, purified HPV 16, 18 VLPs from insect cell transformationn were secured. We applied size exclusion chromatography, in which molecules in solution are separated by their size, Reverse phase chromatography dealing with LI peptide and heparin chromatography HPLC using heparin interacting with HPV VLP to develop a quantification testing method, which was then validated to calculate the linearity, accuracy, precision, detection limit and quantification limit. As a result, in case of HPV 16, the RSD value measured over 3 days was identified below 2.90% in SEC HPLC, 3.44% in Heparin-HPLC and 5.77% in RP-HPLC and in case of HPV 18, the RSD value measured over 3 days was identified below 6.90% in Heparin-HPLC and below 6.90% in RP-HPLC. The r² value of linearity was all above 0.99%. We conducted collaborative studies with manufacturers to validate this new testing method for in-process control(IPC).

Also, we secured HPV 16, 18 intermediate(1^st chromatography eluent, 2^nd chromatography eluent) and applied 2 ways of HPLC method before developed. However, we excluded Heparin-HPLC method due to low detection degree of VLP peak. The final measured concentration of HPV 16 intermediate(1^st chromatography eluent and 2^nd chromatography eluent) in RP-HPLC is 0.05 and 0.02 μg/μl, respectively. Also, the final measured concentration of HPV 18 intermediate(1^st chromatography eluent and 2^nd chromatography eluent) in RP-HPLC is 0.11 and 0.09 μg/μl, respectively. And, we identified VLP contents of intermediate passing though Western blot analysis comparing each band intensity.

We developed Standard Operating Produres(SOP) based on established testing method. We expect to produce cervical cancer vaccine by developing quantification testing method of HPV VLP

( 출처 : SUMMARY 4p )

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 자체연구개발과제 최종보고서 ... 2
• 국문 요약문 ... 3
• Summary ... 4
• 목차 ... 5
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 6
• 제1절 연구개발과제의 목표 ... 7
• 제2절 연구개발과제의 필요성 ... 7
• 제2장 연구개발과제의 국내·외 연구개발 현황 ... 8
• 제3장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과 ... 10
• 제1절 자궁경부암 백신의 정제항원(HPV VLP) 확보 및 VLP 함량시험법 개발 및 밸리데이션 ... 10
• 제2절 자궁경부암 백신의 중간산물 확보 및 상기 개발된 VLP 함량시험법 적용 및 정량 확인 실험 ... 11
• 제3절 자궁경부암 백신 함량 시험법 SOP 마련 및 자궁경부암 백신 함량 시험법 확립 ... 12
• 제4장 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 47
• 제5장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 49
• 제6장 연구개발과제의 연구개발 결과 활용계획 ... 49
• 제1절 연구성과 및 활용계획 ... 49
• 제7장 참고문헌 ... 51
• 첨부 ... 52
• 끝페이지 ... 67