보고서 정보
주관연구기관 |
(주)해강바이오 |
연구책임자 |
이은정
|
참여연구자 |
이종식
,
변영각
,
한규동
,
김성우
,
허경무
,
정남현
,
이지영
,
김병일
,
정혜진
,
김희진
|
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2012-07 |
주관부처 |
농림수산식품부 Ministry for Food, Agriculture, Forestry and Fisheries |
등록번호 |
TRKO201800000873 |
DB 구축일자 |
2019-04-20
|
초록
▼
IV.연구개발결과
1. 길항방선균의 고농도, 고활성 배양조건 확립
○ flask 수준에서 배지조성과 물리적 조건을 검토한 결과, 항균활성이 우수한 균주 중 배양 공정 scale up과 제제화 공정을 고려할 때 A1022균주가 가장 유리할 것으로 판단되어, A1022균주를 대상으로 포자수 확보, 탄저병, 벼도열병에 대한 활성을 기준으로 최적화함.
○ A1022 균주의 최적배지조건, 0.75% soya flour, 0.3% yeast extract, 3.375% glucose, 0.025% CaCO₃, 0.025% M
IV.연구개발결과
1. 길항방선균의 고농도, 고활성 배양조건 확립
○ flask 수준에서 배지조성과 물리적 조건을 검토한 결과, 항균활성이 우수한 균주 중 배양 공정 scale up과 제제화 공정을 고려할 때 A1022균주가 가장 유리할 것으로 판단되어, A1022균주를 대상으로 포자수 확보, 탄저병, 벼도열병에 대한 활성을 기준으로 최적화함.
○ A1022 균주의 최적배지조건, 0.75% soya flour, 0.3% yeast extract, 3.375% glucose, 0.025% CaCO₃, 0.025% MgSO₄·7H₂O.
○ A1022 균주를 5L, 50L, 500L 순으로 시생산 성공하였으며, 이 결과를 바탕으로 배양공정 표준화 함.
2. 배양액을 이용한 제형화 소재 개발 및 제제화 공정 확립
< 제형화 소재 개발 >
○ 제형의 압도 상용성 확보
- Streptomyces sp. A1022 배양액을 60 ± 5°C에서 30분간 열처리 시 활성물질과 포자의 안정성 및 보존성이 무처리구에 비해 우수한 것으로 나타남. 이는 배양 완료 후 열처리 공정 추가로 소량의 비활성물질과 영양세포(vegetative cell)의 제거 효과가 있어 배양액의 안정성과 보존성이 증가한 것으로 판단되며, 이 공정을 후공정에 추가 할 예정임,
- Streptorryces sp. A1022의 활성물질과 포자는 물리적 분쇄와 이때 발생하는 열에 대한 안정성이 확보됨. 따라서 후 공정 중 분쇄 및 기타 공정에서 발생되는 물리적 마찰과 열에 대한 안정성이 확보됨.
- Streptomyces sp. A1022 배양액 분쇄 후 입도가 200mesh(75㎛) 98% 통과함으로 현재 농가에서 가장 많이 사용하고 있는 동력분무기 및 SS 살포기 등에 사용이 가능하므로 사용상의 편리성도 확보됨.
○ 동결 안정제 선발
- Streptomyces sp. A1022 활성물질과 포자는 부재를 처리하지 않은 조건에서 냉동 안정성과 보존성을 확보하였으나, 보조제 검토를 통해 액상수화제와 동결건조 수화제의 동결방지제를 선발함.
- 액상수화제는 동절기 동결안정제는 액상 형태의 glycerol을 선발함.
- 동결건조 수화제의 동결안정제는 분상형태의 lactose를 선발함.
○ 건조부재 선발
- 증량제는 흡습을이 높고, 건조 후 경도가 낮은 부재가 농업용 증량제로 적합함. 따라서 검토결과, silicon dioxide가 수화제 형태의 제형에 가장 적당한 중량제로 선발됨.
○ 계면활성제 선발
- 시험한 게면활성제 중 polyoxyethylene nonylphenyl ether, polyoxyethylene castor ether. polyoxyethylene polyoxypropylene derivatives 등이 사용 가능하나, 습윤, 분산. 침투, 유화제의 기능이 복합적인 polyoxyethylene nonylphenyl ether가 공업화 공정의 적합한 계면활성제로 판단됨.
< 제제화 공정 확립 >
○ Streptomyces sp. A1022를 이용한 시제품은 액상수화제 1종, 수화제 2종 등 총 3종으로 제제화 함.
○ 최종 시제품의 물리성 확인
- Streptomyces sp. A1022 시제품의 물리성 검토 결과, 3종 모두 생물농약 기준에 적합한 것으로 확인됨. 특히, 분말도는 현행 물리성 기준에 따르면, 화학농약은 325mesh(45㎛) 98%, 생물농약은 100mesh(149㎛) 98% 통과를 기준하는데 본 연구의 시제품 3종은 200mesh(75㎛) 98% 통과하므로 모두 적합한 것으로 판단됨.
- 아울러 54±2°C에서 4주일 이상 시험한 결과도 초기의 물리성 결과와 유사한 것으로 확인되어 Streptomyces sp. A1022 시제품 3종의 물리성이 생물농약 기준에 적합한 것으로 확인됨.
○ 최종 시제품의 제형간 약효 비교
- Streptomyces sp. A1022 액상수화제 및 수화제 2종 시제품간의 약효 김토결과, 시제품 3종의 약효는 유사한 것으로 확인됨.
- 54±2°C에서 4주 이상 시험한 결과도 초기의 약효와 유사한 것으로 확인되어 Streptomyces sp. A1022 시제품 3종의 약효는 생물농약 기준에 적합한 것으로 확인됨.
- Streptomyces sp. A1022 액상수화제(시제품)는 희석배수 100배, Streptomyces sp. A1022 수화제(FD type, SD type 시제품)는 희석배수 1,000배가 적합한 것으로 판단됨.
→ 제품의 회석 배수와 생산단가만을 고려하면, Streptomyces sp, A1022 액상수화제(시제품)가 가장 효율적인 제품이라 판단되나, 제품의 보존성, 안정성 및 사용상의 편리성 등은 Streptomyces sp. A1022 수화제(FD type, SD type 시제품) 형태가 더 효율적임.
○ 최종 시제품의 포자수 경시 안정성 분석
- 각 시제품의 포자 경시 안정성 확인 결과, 시간이 경과할수록 포자수가 감소하였으나, 54±2°C에서 4주 이상 시험한 결과도 1.0E+ 7cfu/mL(g) 이상의 포자를 보유한 것으로 확인되어 포자의 경시 안정성도 안정한 것으로 판단됨.
3. 대상병해에 대한 사용방법의 최적화 - POT test
○ 약제 처리시기 분석
- 고추탄저병 이병 전·후 Streptomyces sp. A1022 액상수화제(시제품) 처리결과, 이병전 처리구가 이병후 처리구에 비해 방제가가 우수한 것으로 나타남. 아울러, 고추 수확량도 이병전 처리구가 이병후 처리구에 비해 우수한 것으로 나타남.
○ 약제 처리간격 분석
- Streptomyces sp. A1022 액상수화제 (시제품)을 5일 간격으로 약제 처리한 시험구가 7일 간격으로 약제 처리한 시험구에 비해 방제가가 다소 높게 나타났으나, 약제처리 간격에 따른 방제가의 차이는 크지 않는 것으로 판단됨.
→ 따라서 이병율 15% 수준에서 약제 처리 간격은 7일이 적당한 것으로 판단됨.
○ 약제 처리농도 분석
- 고추 열매를 이용한 시험결과, Streptomyces sp. A1022 액상수화제(시제품) 원액과 10배 희석액 처리구에선 탄저병이 이병되지 않았고, Streptomyces sp, A1022 액상수화제(시제품) 100배 처리구는 오티바(신젠타) 1,000배 처리구와 유사한 이병율을 나타냈음.
- 온실과 POT 시험에서 Streptomyces sp. A1022 액상수화제(시제품) 100배 처리구가 오티바(신젠타) 2,000배 처리구에 비해 우수한 방제가를 나타났고, Streptomyces sp. A1022 액상수화제(시제품) 100배는 오티바 1000배 수준과 유사한 방제효과가를 나타냄.
○ 시제품과 타사제품 탄저병에 대한 방제가 비교
- 타사제품과 약효 비교 결과, 7일차 결과는 Streptomyces sp. A1022 액상수화제 (시제품) 100배 처리구와 대조약제 오티바 1,000배 및 티포라탄 1,000배 처리구가 유사한 방제효과를 나타냈고, Eugenol 500배 처리구는 약효가 매우 떨어지는 것으로 확인됨.
- 12일차 결과는 Streptomyces sp. A1022 액상수화제 (시제품) 100배 처리구와 대조약제 오티바 1,000배는 유사한 방제효과를 나타냈으나, 티포라탄 1,000배 처리구와 eugenol 500배 처리구는 방제효과가 매우 떨어지는 것으로 확인됨.
→ Streptomyces sp. A1022 액상수화제(시제품)을 100배 처리시 약 10일간의 약효 지속효과가 있을 것으로 예상됨.
4. 대상병해에 대한 방제효과 검정 - Field test
○ 1차년도 시험결과를 바탕으로 시설 및 노지에서 고추, 피망, 토마토 등의 작물에 탄저병, 역병, 젯빛곰광이 병에 대하여 Streptomyces sp. A1022 시제품을 희석배수 300배 - 1,000배 적용하여 방제가 60% 이상 확보함.
5. 토양상 변화 관찰
○ 토양미생물상은 Streptomyces sp. A1022 시제품 처리구가 대조구와 무처리구에 비해 시험 완료 후 토양미생물상이 증가한 것으로 나타남.
○ 토양이 화학상 변화는 유기물과 수분은 모든 처리구에서 유사한 것으로 나타났고, 질소와 가리는 시험종료 후 모든 처리구에서 감소한 것으로 확인됨. 반면, 인산은 대조구와 부처리구는 시험전 후 비슷한 수준이었으나, Streptomyces sp. A1022 시제품 처리구의 인산 함량이 시험 종료 후 줄어든 것으로 확인됨.
→ Streptomyces sp. A1022는 인산분해능이 어느 정도 있는 것으로 판단되고, 이는 현재 농지에서 문제가 되는 인산집적 현상을 다소 해결할 수 있을 것으로 기대됨.
○ 뿌리생육은 3개 시험구 모두 뿌리 생육은 유사하였으나, 시제품 처리구 > 대조구 > 무처리구 순으로 뿌리의 길이 생육이 활발한 것으로 확인됨.
6. 친환경자재 및 토양미생물제제 등록시험 진행
○ 친환경농자재 및 토양미생물제제로 등록함,
7. 길항방선균으로부터 생성되는 항균물질의 분리, 정제 및 구조동정
○ Streptomyces sp, A1022 배양액 균체로부터 용매분획, silical gel chromatography, Sephadex chromatography, prep. HPLC 등의 분석을 통해 식물병원균에 활성을 지니는 단일 물질을 분리함.
○ 최종 물질은 1H, 13C, COSY, HMBC, HSQC, DEPT 등의 분석을 통해 당지질(glycolipid)로 예상되며 정확한 구조는 동정 중임.
(출처 : 요약문 6p)
Abstract
▼
〇 Reseach results
Streptomyeces sp. A1022 strains was selected and produced successfully in scale of 5, 50, 500 Liter fermenter. Based on these results, fermentation process was standardized.
- A semi-commercial biofungicide was formulated by selecting filler and stabilizing materials. And its
〇 Reseach results
Streptomyeces sp. A1022 strains was selected and produced successfully in scale of 5, 50, 500 Liter fermenter. Based on these results, fermentation process was standardized.
- A semi-commercial biofungicide was formulated by selecting filler and stabilizing materials. And its production process (SOP) for 1 solid concentrate and 2 wettable powder was obtained. Final physical properties, efficacy comparison of 3 biofungicides, and change in stability for long period was examined for the final standard operation procedure.
- Biofungicide treatment time table, treatment interval, application concentration, comparison between our product and other’s products was performed in POT test, through which various informations for proper usage of the biofungicide was obtained.
- In green house and field trials, the semi-commercial biofungicides was applied by dilution of 300 ~ 1000 times to vegetables such as pepper, pmang, and tomato against various plant diseases such as gray mold, late blight, and anthracnose. Desease control value was more than 60%.
- Positive change in soil was observed for the increase in microbial population density, phosphate mobilization, root length after application of biofungicides.
- All developed biofugicides was registered as eco-friendly agricultural instrument and soil biofungicides.
- CuIture broth and cell mass was solvent-fractionated to pass through classical procedure for the isolation of bioactive compound. The procedure included silica gel chromatography, Sephadex chromatography, preparative HPLC. The bioactive compound was analyzed using 1H, 13C, COSY, HMBC, HSQC, DEPT and estimated as a glycolipid.
(출처 : SUMMARY 11p)
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 제출문 ... 2
- 요약문 ... 3
- SUMMARY ... 11
- CONTENTS ... 13
- 목차 ... 14
- 제1장 연구개발 과제의 개요 ... 15
- 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 16
- 1. 국내 기술개발 현황 ... 16
- 2. 국외 기술개발 현황 ... 17
- 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 18
- 1. 균주선발 ... 18
- (1) 식물병원균 ... 18
- (2) 항균성 검정 ... 18
- (3) Vegetative cell, Spore cell 계수 ... 19
- (4) 균주선발 ... 19
- 2. 균주동정 ... 21
- (1) 형태 및 생화학적 분석 ... 21
- (2) 균체지방산 조성 분석 ... 23
- (3) 16S rDNA 염기서열 분석 ... 23
- (4) DNA gyrase subunit B(gyrB) 염기서열에 기초한 분자계통학적 분석 결과 ... 27
- (5) 결론 ... 28
- 3. Streptomyces sp. A1022의 고농도, 고활성 배양조건 확립 ... 29
- (1) 기본 배지조성 검토 ... 29
- (2) 탄소원, 질소원 검토 ... 30
- (3) 통계적 방법에 의한 배지최적화 ... 32
- (4) 무기염류 검토 ... 36
- (5) Flask 수준에서 물리적 조건 검토 ... 37
- (6) Jar fermenter 수준에서 물리적 조건 검토 ... 41
- (7) 시생산 ... 43
- 4. Streptomyces sp. A1022의 제형화 소재 개발 및 제제화 공정 확립 ... 50
- 가. Streptomyces sp. A1022 배양액을 이용한 제형화 소재 개발 ... 50
- 나. Streptomyces sp. A1022의 제제화 공정 확립 및 SOP 작성 ... 62
- 5. 대상병해에 대한 사용방법 최적화 ... 78
- (1) 처리시기 ... 78
- (2) 처리간격 ... 88
- (3) 처리량(처리농도) ... 89
- (4) 시제품과 타사제품 탄저병에 대한 방제가 비교 ... 91
- (5) 기타 방제효과 _ 토마토 탄저병 ... 93
- (6) 기타 방제효과 _ 토마토 역병 ... 93
- 6. 포장실증실험 ... 95
- (1) 포장실증 _ 1 ... 96
- (2) 포장실증 _ 2 ... 98
- (3) 포장실증 _ 3 ... 99
- (4) 포장실증 _ 4 ... 101
- (5) 포장실증 _ 5 ... 102
- (6) 포장실증 _ 6 ... 103
- 7. 토양상 변화 관찰 ... 104
- 방선이의 급성경구독성시험 결과보고서 ... 115
- 방선이의 급성경피독성시험 결과보고서 ... 126
- 방선이의 잉어에 대한 급성어독성시험 결과보고서 ... 137
- 비효 및 비해연구 결과 보고서(토양미생물제제 #I) ... 149
- 비효 및 비해연구 결과 보고서(토양미생물제제 #II) ... 155
- 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 209
- 1. 연구성과 목표 ... 209
- 2. 연구성과 활용 목표 ... 211
- 제5장 연구개발 성과 및 성과활용 계획 ... 212
- 제6장 참고문헌 ... 213
- 끝페이지 ... 216
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