초록 ▼

1. LRS와 RagD 사이의 상호작용을 조절하는 화합물을 도출하기 위해 상호작용의 정도를 SPR을 이용해 정량적으로 측정하고 충분한 상호작용을 위해서 필요한 단백질의 크기를 결정하였으며 in silico 단백질 분석 시스템을 이용하여 unnatural amino acid의 도입 자리를 결정함.
2. FRET-based PPI modulator 스크리닝 시스템을 개발을 위해 단백질의 특정 위치에 unnatural amino acid를 삽입하기 위한 기술을 확보하였고 이를 LRS와 RagD에 적용하였음. 그에 따라 DNA eng

1. LRS와 RagD 사이의 상호작용을 조절하는 화합물을 도출하기 위해 상호작용의 정도를 SPR을 이용해 정량적으로 측정하고 충분한 상호작용을 위해서 필요한 단백질의 크기를 결정하였으며 in silico 단백질 분석 시스템을 이용하여 unnatural amino acid의 도입 자리를 결정함.
2. FRET-based PPI modulator 스크리닝 시스템을 개발을 위해 단백질의 특정 위치에 unnatural amino acid를 삽입하기 위한 기술을 확보하였고 이를 LRS와 RagD에 적용하였음. 그에 따라 DNA engineering을 통해 LRS와 RagD의 특정 위치에 amber codon을 도입하였고, 각 단백질의 최적 발현 호건을 찾아냄.
3. 세포 내 autophagy process를 조절하는 저분자 화합물의 발굴에 Lipid droplet(LD)-specific staining bioprobe를 활용한 image-based high contents screening 시스템이 이용될 수 있음을 증명하였음.

(출처 : 보고서 요약서 3p)

Abstract ▼

Recently, several research papers revealed that aminoacyl tRNA synthetases (ARS) play significant roles in tumorigenesis through the interaction with other protein factors. Especially, leucyl tRNA synthetase(LRS), one of ARSs, has a specific interaction with RagD and influences the tumor activation.

Recently, several research papers revealed that aminoacyl tRNA synthetases (ARS) play significant roles in tumorigenesis through the interaction with other protein factors. Especially, leucyl tRNA synthetase(LRS), one of ARSs, has a specific interaction with RagD and influences the tumor activation. In this research, we aim to develop new Fluorescence Resonance Energy Transfer(FRET)-based screening system to monitor the protein-protein interaction(PPI) to identify bioactive small-molecule modulators that can selectively modulate PPI between these two proteins. In addition to this FRET-based screening method, we also aim to develop a novel screening system for the efficient identification of small molecule modulators on cellular autophagy process through the establishment of dual screening system platform.
To analyze the direct binding interaction between LRS and RagD, we used Surface Plasmon Resonance(SPR) technology to measure the binding affinity of two proteins, and identified minimum fragment of each proteins. This basic biophysical research provides the essential information on their relationship toward tumorigenesis and the minimum structural unit of their PPI. Based on the information obtained from SPR study, we will produce LRS and RagD containing unnatural amino acid at a specific site. Unnatural amino acid will allow the development of FRET-based PPI screening system. We have introduced amber codon at the gene of LRS and RagD after analyzing their 3-dimensional structure. Lastly, using selectively incorporated unnatural amino acid at the amber codon site, we will attach fluorescent reporter and quencher molecule on each protein using bioorthogonal click reaction to derive efficient screening method finding bioactive small molecule that inhibit the interaction of LRS and RagD. Along with above - mentioned screening system, we also aim to set up the image-based high content screening system using lipid droplet(LD)-specific staining bioprobe developed in our group for the efficient discovery of novel small molecule modulators on autophagy. Ultimately we anticipate synergistic effects of this dual screening system for the discovery of novel LRS-related anticancer agents.
Based on our HCS system using FRET-based PPI event and LD-specific staining bioprobe, the efficiency in the discovery process for the novel therapeutic agents which can inhibit LRS related activation of tumorigenesis or leucine depletion induced autophagic pathway can be significantly improved and they can be applied for the development of novel anti cancer agents. In addition, the discovery of novel biological active compound can be utilized to understand the mechanism of cancer cell activation following development of next generation anti cancer drug candidates

(출처 : SUMMARY 6p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 보고서 요약서 ... 3
• 요약문 ... 4
• SUMMARY ... 6
• CONTENTS ... 7
• 목차 ... 8
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 9
• 제1절 연구개발 대상 기술의 중요성 ... 9
• 제2절 연구 범위 및 목적 ... 11
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 12
• 제1절 화학생물학 연구 현황 ... 12
• 제2절 Aminoacyl-tRNA synthetases의 새롭게 밝혀진 기능 ... 14
• 제3절 Autophagy와 관련된 Leucine의 역할 및 LRS-RagD의 protein-protein interaction ... 15
• 제4절 Autophagy 중요성 및 screening의 제한점 ... 16
• 제3장 연구개발 수행 내용 및 결과 ... 18
• 제1절 분자다양성 확보 ... 18
• 제2절 FRET-based PPI 스크리닝 시스템 구축 ... 20
• 1. RagD와 상호 작용에 필요한 LRS의 작용 단위 확인 ... 20
• 2. FRET-based PPI 스크리닝 시스템 구축 ... 21
• 3. 단백질 구조 분석을 통한 UA 도입위치 결정 및 Genetic Engineering ... 22
• 4. Unnatural amino acid가 삽입된 단백질의 발현 및 형광 표지 ... 23
• 제3절 LD bioprobe의 개발 및 이를 응용한 autophagy modulator screening system의 구축 ... 24
• 1. 지방 방울(lipid droplet, LD) 선택적인 형광 프로브의 개발 ... 24
• 2. LD level과 autophagy process가 역 상관관계에 있음을 증명 ... 25
• 3. SF44를 이용한 LD level monitoring의 HCS 시스템 구축 ... 25
• 4. HCS 시스템을 이용한 활성 저분자 물질 도출 ... 28
• 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 29
• 제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 30
• 제6장 연구개발 과정에서 수집한 해외 과학기술정보 ... 31
• 제1절 Unnatural amino acid가 도입된 단백질을 생산하는 방법 ... 31
• 제2절 표현형 기반 탐색법과 표적 규명 연구 ... 32
• 제7장 연구시설·장비 현황 ... 35
• 제8장 참고문헌 ... 36
• 끝페이지 ... 36