초록 ▼

〇 연구개발 목표 및 내용
최근 증가 하고 있는 항생제 사용으로 인하여 장내 균총의 파괴 및 불균형이 심화 되고 문제가 되므로 다양한 유용미생물의 보고인 김치로부터 유래한 김치미생물을 이용하여 항생제에 의한 균총 파괴 완화 및 김치미생물 섭취에 의한 장내 균총의 변화 양상을 분석하고자 한다.

〇 연구결과
(1) 김치미생물의 동결 건조 후 특성 분석
동결건조 직후에는 모든 균주가 10⁸cfu/g 이상의 생균수를 나타내었다. -20℃：에 보관하였을 때, 7일차 14일차 모두 4°C 보다

〇 연구개발 목표 및 내용
최근 증가 하고 있는 항생제 사용으로 인하여 장내 균총의 파괴 및 불균형이 심화 되고 문제가 되므로 다양한 유용미생물의 보고인 김치로부터 유래한 김치미생물을 이용하여 항생제에 의한 균총 파괴 완화 및 김치미생물 섭취에 의한 장내 균총의 변화 양상을 분석하고자 한다.

〇 연구결과
(1) 김치미생물의 동결 건조 후 특성 분석
동결건조 직후에는 모든 균주가 10⁸cfu/g 이상의 생균수를 나타내었다. -20℃：에 보관하였을 때, 7일차 14일차 모두 4°C 보다 모든 균주의 생존율이 우수하였다. -20°C에 보관하였을 경우 7일차에서 66%의 생존율을 보인 L. brevis와 20%의 생존율을 보인 P. pentosaceus를 제외한 대부분의 균주가 70%이상의 생존율을 유지하였으며 W. confused는 100%를 나타내었다. 4℃ 7일차의 경우 W. confusa가 85%, L. plantarum, L. citreum, L. sakei가 70% 이상의 생존율을 보였으며, L. lactis, L. rermentum, L. fermentam. L. mesemteroides가 60%대의 생존율을 나타내었다.

(2) 김치미생물의 항생제 특성 분석
그람양성균인 김치미생물의 항생제 저항성을 보기 위해 다양한 항생제로 MIC를 측정하였다. 실험의 결과, 10종의 김치미생물 모두 ketoconazole, fluconazole과 같은 세포막의 기능을 억제하는 azole계열 항생제에 10ug/ml 농도에서도 저항성을 가지는 것을 확인하였다. Ciprofloxacin 의 경우 L.mesenteroides가 2.5ug/ml 농도에서 저항성을 보이는 것을 제외하고 나머지 9종의 김치미생물이 10ug/ml 농도에서 생존하였으며，Trimethoprim의 경우도 L. fermentum 균주만이 1.25ug/ml에서 저항성을 보였고, 나머지 9종의 김치미생물은 10ug/ml에서도 생존하였다. Vancomycin은 8종의 김치미생물에서 10ug/ml의 MIC를 나타내었고 L. acidoptdllus와 L. lactis가 1ug/ml 미만의 낮은 농도에서 생육이 저해되는 것을 확인하였다. P. pentosaceusd은 항생제 11종에 대해 전반적으로 높은 저항성을 보였으며, L. plantmwn도 moxifloxacin에 2.5ug/ml 농도의 MIC를 갖는 것을 제외하고는 10종의 항생제에 비교적 높은 저항성을 보이는 것을 알 수 있었다.

(3) 동물 모델을 이용한 항생제의 장내 균총 불균형 및 김치미 생물 섭 취에 의한 복원
항생제 처리 1주, 2주와 비교하여 항생제 처리 후 김치미생물을 처리 하였을 때 Bacteroidetes가 유의하게 증가하고, Firmicutes가 감소하는 것을 알 수 있었다. Clostridium은 Firmicutes에 속하는 genus로, Clostridium cluster 1에 속하는 C. perfringens 나 Clostridium cluster XI에 속하는 Clostridium difficile 경우 Gram-positive spore forming bacteria로 host intestine에 pathogenesis한 성격을 갖는다. 전반적으로 항생제 처리 그룹과 비교하여 항생제 처리 전 그룹，항생제 처리 후 김치미생물을 처리하였을 때 Clostridium sp. 가 유의하게 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 항생제 처리로 인하여 host에 negative effect를 줄 수 있는 미생물 균총이 증가하는 반면 김치미생물 처리로 인하여 그러한 미생물이 감소하는 결과를 얻었다.

(4) CDAD (위막성 장염) 환자의 김치미생물 섭취
동결 건조된 김치미생물 10종을 섭취하였을 때, 섭취 전과 비교하여 장내 미생물 균총의 변화를 분변을 이용하여 metagenomic analysis로 확인하였다. 환자에 따라 약간의 차이는 있었지만 장내에 존재하는 Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Weissella의 비율이 증가하였다. 또한, 유해균 속(屬)으로 알려졌으며 인체에 장질환을 유발하는 Clostridium의 비율이 감소한 것을 알 수 있었다. 뿐만 아니라, Salmonella의 장내 생존율도 감소하였다.

〇 연구성과 및 성과활용 계획
1. 연구성과
(1) 학술대회 발표 2건
2014. 한국미생물 생명공학회 포스터 및 구두발표
(2) 특허
출원번호: 10-2014-0086872, 락토바실러스플란타룸 W I K I M 1 8 및 이를 포함하는 조성물
(3) 논문
Jang JY, Lim HI, Park HW, Choi H-J, Kim T-W, Kang M, Lee J-H. 2014. Draft genome sequence of Lactobacillus plantarum wikim18, isolated from Korean kimchi. Genome Announc. 2(3):e00467-14. doi: 10.1128/genomeA.00467-14.

2. 성과할용 계획
특허 관련 기술 이전 및 김치미생물의 장내 균총 개선 효과에 대한 홍보

(출처 : 연구개발보고서 초록 9p)

Abstract ▼

Fermented vegetables are among the oldest traditional food. They are made by fermentation of local vegetables and lactic acid bacteria (LAB), which have a key role in the fermentation stages. LAB itself is likewise used as probiotic additives because of its diverse useful aspect in human wellness.

Fermented vegetables are among the oldest traditional food. They are made by fermentation of local vegetables and lactic acid bacteria (LAB), which have a key role in the fermentation stages. LAB itself is likewise used as probiotic additives because of its diverse useful aspect in human wellness.
Recent technological achievements make it potential for analyzing total bacterial complex without cultivation. A technology led an innovation in the monitoring of the bacterial population with an isolated DNA from environments as food or fecal sample. LAB has been employed for the fermentation and it plays a part in a major supplement for the bacteria. Kimchi is a representative fermented food in Korea. It contains diverse LAB including Lactobacillus sp, Weissellia sp, and Leuconostoc sp. The Intestinal bacterial population changes according to environmental stress, such as fermentation of food, limitation of nutritional supplement, and treatment of bactericidal materials. The correlation between LAB diet and affecting in intestinal bacteria community needs to be analyzed to understand the LAB behave in the intestine.
In this study, we monitored the intestinal bacterial community changes by metagenomic analysis approach and collecting the bacteria associated with LAB supplement.
LAB was isolated from kimchi and primary identified by 16S rRNA sequencing, previously. On this, acid tolerance and bile resistance of LAB were examined and L. plantarum and L. citreum strains showed relative viability while L. lactis and L. sake strains were defected in acid tolerance and biliary resistance at pH 4 and 0.3% bile salt for 2 hours at 37 °C, respectively. Antibiotic resistance was tested by a diverse spectrum of antibiotics, including vancomycin (inhibits the cell wall synthesis), ciprofloxacin (inhibition of DNA gyrase), chloramphenicol (inhibition of protein synthesis), and tetracycline (aminoacyl-tRNA binding inhibition). The L. plantarum and L. citreum also showed the resistant vancomycin, ciprofloxacin, chloramphenicol, tetracycline at 10ug/ml concentration.
The bacteria is also tested in mouse model with antibiotics treatment and hospitialized patent who have CDAD (Clostoridium difficile Associated Disease) positive symptoms. The results showed that supplements of LAB enhance the clearance of Clostridium sp. in animal model and LAB also increased in the human fecal among the CDAD patient.
Proteomic and metabolomic approaches indicated the difference in the bacterial growth. Carbohydrate metabolites are related to protein expressed at the late stage of growth, while DNA replication is related to protein expressed earlier stage of the growth. We also sequence the whole genome of L. plantarum wikim 18 which showed the antibiotics and acid tolerance feature among the tested LAB. The genome sequence was annotated using RAST genome annotation servers. The contigs of L. plantarum wikim 18 were annotated to have 336 subsystems, 3,316 coding sequences, and 66 RNAs.
RAST server identified the genes present in the test strain genome, but not in the reference genome. Among these genes were those encoding a GlpG protein, glyceraldehyde-3-phosphate ketol-isomerase, and inosose isomerase associated with sugar alcohol production. The draft genome sequence of L. plantarum described in this report will help the understanding the future in kimchi fermentation.

(출처 : SUMMARY 6p)