초록 ▼

□ 연구의 목적 및 내용
지금까지 밝혀진 Long intergenic non-coding RNA (lincRNA)를 유전체 전체적인 측면에서 (genome-wide manner) 녹아웃할 수 있는 유전자가위 라이브러리를 제작하고, 이를 이용하여 암세포의 증식에 관련된 lincRNAs를 새롭게 발굴하고, 검증하는 것을 목표로 함. 이를 통해 암의 치료에 기여할 수 있는 새로운 약물 표적 및 치료 원천 기술을 개발하고자 함.

□ 연구결과
○LincRNA library를 클로닝할 벡터 플랫폼 개발 및 LincRNA

□ 연구의 목적 및 내용
지금까지 밝혀진 Long intergenic non-coding RNA (lincRNA)를 유전체 전체적인 측면에서 (genome-wide manner) 녹아웃할 수 있는 유전자가위 라이브러리를 제작하고, 이를 이용하여 암세포의 증식에 관련된 lincRNAs를 새롭게 발굴하고, 검증하는 것을 목표로 함. 이를 통해 암의 치료에 기여할 수 있는 새로운 약물 표적 및 치료 원천 기술을 개발하고자 함.

□ 연구결과
○LincRNA library를 클로닝할 벡터 플랫폼 개발 및 LincRNA의 large deletion 시스템 구축
-high throughput efficient sgRNA screening platform을 구축
-한 쌍(2개)의 sgRNA를 동시에 발현할 수 있는 벡터 플랫폼을 개발
-클로닝 효율을 최적화하기 위한 실험을 진행하여 최적의 조건을 확립
-genome상의 large region(200kb 이상)의 deletion이 일어남을 PCR 실험 및 RNA sequencing을 통해 확인.
○유전자가위를 발현하는 암 세포주의 제작 및 작동여부 검증
-대장암 세포주(SW403, SW620)에 Cas9을 lentivirus를 이용해 전달
-Cas9 발현 암세포주에 doxycyclin inducible sgRNA를 transfection 한 후 PCR 및 T7E1 assay를 이용하여 유전자가위에 의한 유전자교정이 일어났는지 확인.
○대상 lincRNA의 선정 및 sgRNA 설계 및 sgRNA들을 벡터 플랫폼에 탑재
-인간 게놈을 분석하여 기존의 lincRNA database를 개량한 lincRNA site를 선정
-기존의 sgRNA의 효율 예측 방법을 보완한 새로운 scoring system을 제작함.
-대장암 세포주에서 위 플랫폼이 효과적으로 유전자 교정을 일으키는 것을 확인
○ sgRNA library를 이용하여 in vitro knockout screening 실행 및 암세포 증식을 유도하는 lincRNA의 후보군 선정 및 분석
-암세포주 상에서 in vitro knockout screening을 통해 암세포 증식을 유도하는 lincRNA site 및 KRAS 유전자 site를 선정
-paired sgRNA를 design, 세포주상에서 적용하여 target lincRNA의 deletion을 유도함.
-KRAS 유전자를 manipulation했을 때 종양세포의 증식이 억제되는 것을 확인
-동물 모델에서 종양증식의 억제를 유발함을 확인

□ 연구결과의 활용계획
○ 본 연구에서 확립한 high throughput guide RNA screening 방법을 이용하여 유전자 가위 자체의 활성을 평가할 수 있는 데이터베이스를 구축할 수 있음.
○ 전체 유전자 중 noncoding genome 영역의 기능 탐색에 위 연구결과를 활용할 수 있음. 위 방법을 통해 원하는 lincRNA뿐 아니라 noncoding element를 효과적으로 knockout할 수 있는 플랫폼을 구축함.
○ 본 연구에서 확립한 기술을 바탕으로, 새로운 암 치료제의 target을 발굴할 수 있음.
(출처 : 한글요약문 4p)

Abstract ▼

□ Purpose & contents
The purpose of our study is to construct genome-wide knockout CRISPR library for Long intergenic non-coding RNA (lincRNA) and to discover and evaluate lincRNAs which controls proliferation of cancer cells and find out new cancer markers. Using this system, we will discover no

□ Purpose & contents
The purpose of our study is to construct genome-wide knockout CRISPR library for Long intergenic non-coding RNA (lincRNA) and to discover and evaluate lincRNAs which controls proliferation of cancer cells and find out new cancer markers. Using this system, we will discover novel drug target for treatment of cancer as well as related novel therapeutic approaches.

□ Result
○ Acquire vector platform to clone linkRNA library
- Construction of high throughput efficient sgRNA screening platform
- Develop a vector platform for simultaneous co-expression of two sgRNAs
- Optimize the cloning efficiency and condition, functionality of vector platform
- After transfection of one-pair sgRNAs on mammalian cells, prove the deletion of target lincRNA gene via PCR, T7E1 assay and RNA sequencing
○ Construct the genome-editable cancer cell line
- Deliver lentiviral Cas9 plasmid to cancer cell line
- Isolate the transfected cell line for stable expression of Cas9
- Validate the genome corrective ability of Cas9 of isolated cancer cell line and confirm the cleavage activity of Cas9 endonuclease via T7E1
○ Select target lincRNA and design sgRNA
- Categorize lincRNAs analyzed from human genome and determine the base sequence of sgRNA library to delete specific lincRNA one-by-one
- Combine selected sgRNAs into vector platform, which eventually gives a potential to construct the final lentiviral library
○ In vitro knockout screening by sgRNA library
- Selection of lincRNA　and KRAS sites in cancer cell line by in vitro screening
- Deletion of target sites by paired sgRNA in cancer cell lines
- Confirmed that cancer cell growth was restricted after manipulation of KRAS gene in cancer cell line and animal model

□ Expected Contribution
1) Through our high throughput guide RNA screening system, we could establish new database for prediction of guide RNA efficiency in silico.
2) We established efficient knockout system to reveal function of noncoding genomic elements as well as lincRNA.
3) Shed a new light on developing the cancer therapeutics based on revealing the role of lincRNA in cell regulation mechanism
(출처 : SUMMARY 5p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 목차 ... 2
• 연구계획 요약문 ... 3
• 연구결과 요약문 ... 4
• 한글요약문 ... 4
• SUMMARY ... 5
• 연구내용 및 결과 ... 6
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 6
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 7
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 8
• 4. 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 19
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 22
• 6. 연구과정에서 수집한 해외 과학기술정보 ... 23
• 7. 주관연구책임자 대표적 연구실적 ... 24
• 8. 참고문헌 ... 24
• 9. 연구성과 ... 25
• 10. 국가과학기술지식정보서비스에 등록한 연구시설‧장비 현황 ... 27
• 11. 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전조치 이행실적 ... 28
• 별첨1. 대 표 연 구 실 적 ... 29
• 별첨2. 세부 목표 관련 증빙 ... 44
• 끝페이지 ... 47