초록 ▼

유도만능줄기세포(Induce Pluripotent Stem Cell, iPSC)는 배아줄기세포와 달리 체세포를 이용하기 때문에 윤리적인 문제를 해결한 새로운 대안으로 부각 받고 있는데, iPSC나 배아줄기세포를 이용한 줄기세포치료제 개발이 증가하면서 유전자 이입, 활성인자, 억제제 처리 등 다양한 분화기술이 도입되고 있고, 이러한 분화기술의 차이에 따라 분화률 및 종양원성 등 품질 및 안전성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구는 인간 iPSC를 확보하고 유지 배양을 통해 목적 세포(심근 세포) 분화유도 시험법을 확

유도만능줄기세포(Induce Pluripotent Stem Cell, iPSC)는 배아줄기세포와 달리 체세포를 이용하기 때문에 윤리적인 문제를 해결한 새로운 대안으로 부각 받고 있는데, iPSC나 배아줄기세포를 이용한 줄기세포치료제 개발이 증가하면서 유전자 이입, 활성인자, 억제제 처리 등 다양한 분화기술이 도입되고 있고, 이러한 분화기술의 차이에 따라 분화률 및 종양원성 등 품질 및 안전성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구는 인간 iPSC를 확보하고 유지 배양을 통해 목적 세포(심근 세포) 분화유도 시험법을 확립한 후, 심근세포 분화 전후의 특성 비교 분석을 통해 iPSC에 관한 품질 평가 기준 등으로 활용하고자 한다. 본 연구에서 사용된 iPSC는 국가줄기세포은행으로부터 분양받은“hFSiPSC-1”이며, 이 세포는 Sendai virus를 이용하여 만들어졌다. iPSC를 유지 배양을 통해 안정화 후 마이코플라스마 오염여부를 확인하기 위해 부정시험을 수행한 결과 미검출로 오염이 되지 않았음을 확인하였고, 유지 배양에 따른 유전체 손상여부를 확인한 결과 정상 핵형으로 판명되었다. iPSC의 줄기세포능(Stemness) 확인을 위해 Alkaline phosphatase(AP) 염색과 stemness 지표인 Oct4, SOX2, TRA-1-60, SSEA-4를 Immunocytochemstry(ICC)를 통해 iPSC의 특성이 잘 유지되고 있음을 확인하였다. 다음으로 심근 세포로 유도하는 분화 실험을 진행하여 심근 세포로 분화되고 있음을 형태학적으로 관찰하고, 심근 분화 초기 단계인 중내배엽 지표 염색을 통해 심근 분화가 진행되고 있음을 확인하였고, 최종적으로 분화 15일차에 심근 박동을 확인하여 심근세포 분화법을 확립하였다. 분화 전 후의 관련 유전자의 발현 변화를 확인하기 위해, qPCR를 통해 분화전후(iPSC, Day15, Day30) 관련 유전자 발현을 분석하였다. iPSC 지표 (SOX2, OCT4, Nanog 등)는 분화가 진행될수록 감소하였고, mesoderm 지표(MSX-1, ISLET1 등)는 분화가 진행될수록 증가하는 양상을 보이나, MSX-1은 중간단계(DAY11)에서 가장 발현이 높았다. Cardiomyocyte 지표(cTnT, MYL7, MYH7 등)가 분화가 진행될수록 증가하는 양상을 보였다. 이렇게 발현량이 변화하는 유전자를 대상으로 더 세분화된 분화단계별로, 유전자(qPCR), 단백질(Western Blot, ICC), 세포(flow cytometry)수준에서 발현량을 분석하였다. qPCR 결과 iPSC지표(Oct4, Nanog)는 분화가 진행될수록 발현이 감소하고, Mesoderm 지표는 분화의 중간단계에서 가장 발현이 높았으며, Cardiomyocyte 지표는 Day 15에서 가장 많이 발현되었다. Western Blot analysis 결과는 OCT4는 분화가 진행될수록 감소하고, cTnT, MYH7은 분화단계의 마지막에서 가장 많이 발현되었다.

이러한 결과들은 ICC 에서도 관찰되었다. iPSC 지표인 OCT4, SSEA4는 iPSC에서 가장 많이 발현되다가 분화가 진행될수록 서서히 감소되는 것을 알 수 있다. Mesoderm 지표인 ISLET1은 분화유도 후 즉시 발현이 증가하여 분화의 중간단계인 Day 5-7에 가장 많이 발현되고, 심근세포로 분화가 완성되는 Day 15에는 감소하는 결과를 보인다. 분화된 심근세포의 특징을 보여주는 cardiomyocyte 지표인 cTnT, MYH7, TBX5, NKx2.5는 iPSC에서는 거의 발현되지 않다가 분화 진행 동안 발현이 증가되며, Day 15에는 가장 강하게 발현되었다. Flow cytometry 실험을 통해, OCT4, SOX2는 분화가 진행될수록 발현세포비율이 감소하고, ISLET1은 분화중간단계(Day5)에 가장 많이 발현되고, 분화가 진행될수록 감소한다.심근분화가 진행될수록 Cardiomyocyte 지표인 cTnT, MYH7를 고도로 발현하는 세포의 비율이 늘어난다.

이러한 결과를 바탕으로, 유도만능줄기세포 유래 심근세포의 품질평가 지표로 OCT4(iPSC지표), cTnT, MYH7 (Cardiomyocyte 지표), ISLET1(mesoderm 지표)을 제안하고자 한다.

(출처 : 국문 요약문 3p)

Abstract ▼

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are expected to yield novel therapies with the potential to solve many issues involving incurable diseases, drug development, because iPSCs are free for the ethical and immunological problems that have obstructed the clinical applications of embryonic stem cell

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are expected to yield novel therapies with the potential to solve many issues involving incurable diseases, drug development, because iPSCs are free for the ethical and immunological problems that have obstructed the clinical applications of embryonic stem cells. However, as iPSCs research has progressed, new problems have emerged that need to be solved for clinical application of iPSCs. For example, iPSCs have defects on genetic instability caused by integration of reprogramming transgenes and accumulation of mutations during the reprogramming process and cell passaging. Thus, that is required that a comprehensive understanding of characterization and quality control about differentiation from iPSCs. In this study, undifferentiated iPSCs was incubated in feeder-free culture medium. Their genetic stability was checked by karyotype analysis and characteristics of undifferentiation were identified by Alkaline Phosphatase (AP) assay and Immunocytochemistry (OCT4, SOX2, TRA-1-60, and SSEA-4). iPSCs were differentiated to cardiomyocytes in optimal condition that 0.5~1x10⁶cells/well and matrigel were required. After 15 days the beating cluster of cells were observed. Each stage of differentiation was investigated by qPCR, Western blot, immunocytochemistry and flow cytometry with iPSC markers (OCT4, nanog, SOX2, and SSEA4), mesoderm markers(MSX-1, ISLET1), and cardiomyocyte markers(cTnT, MYL7, MYH7, TBX5). During differentiation expression of iPSC markers was decreased but cardiomyocyte markers were increased. Mesoderm markers have the highest expression in middle stage of differentiation. These results shows that OCT4(iPSC marker) cTnT(Cardiomyocyte), MYH7(Cardiomyocyte marker), ISLET1 could play a role as quality control marker of iPSC derived cardiomyocyte.

(출처 : Summary 5p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 자체연구개발과제 최종보고서 ... 2
• 국문 요약문 ... 3
• Summary ... 5
• 목차 ... 7
• 연구개발과제 연구결과 ... 8
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 8
• 제2장 총괄연구개발과제의 국내·외 연구개발 현황 ... 13
• 제3장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과 ... 14
• 제4장 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 40
• 제5장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 43
• 제6장 연구개발과제의 연구개발 결과 활용계획 ... 44
• 제7장 참고문헌 ... 45
• 제8장 첨부서류 ... 48
• 끝페이지 ... 52