보고서 정보
주관연구기관 |
농림축산검역본부 Animal and Plant Quarantine Agency |
연구책임자 |
이경기
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참여연구자 |
김성희
,
김연희
,
문보연
,
박지영
,
윤순식
,
이현경
,
김종완
,
김하영
,
소병재
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2017-12 |
과제시작연도 |
2017 |
주관부처 |
농림축산식품부 Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs(MAFRA) |
과제관리전문기관 |
농림축산검역본부 Animal and Plant Quarantine Agency |
등록번호 |
TRKO201800042133 |
과제고유번호 |
1545014827 |
사업명 |
농림축산검역검사기술개발 |
DB 구축일자 |
2018-10-20
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키워드 |
돼지델타코로나바이러스.유병률.유전자진단법.병원성.Porcine deltacoronavirus.prevalence.genetic characteristics.pathogenicity.
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DOI |
https://doi.org/10.23000/TRKO201800042133 |
초록
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◦제1세부과제명: 국내 PDCoV 감염실태 및 특성 조사
1. 국내 양돈장 PDCoV 검색을 위해 시료 수집 체계 구축
- 능동적 검색을 위해 양돈컨설팅 수의사(7개 그룹, 10인)와의 시료 수집 네트워크를 구성하고, 감염의심 농장에 대한 시료를 수집함
- 수동적 검색을 위해 검역본부로 의뢰되는 설사병관련 병성감정 시료와 돼지소모성질환 지도·지원사업관련 위축돈 시료를 수집함
2. PDCoV 단일 및 동시감별(PDCoV/PEDV/TGEV) 유전자진단법 확립
- 국내에는 표준화 PDCoV 유전자진단법이
◦제1세부과제명: 국내 PDCoV 감염실태 및 특성 조사
1. 국내 양돈장 PDCoV 검색을 위해 시료 수집 체계 구축
- 능동적 검색을 위해 양돈컨설팅 수의사(7개 그룹, 10인)와의 시료 수집 네트워크를 구성하고, 감염의심 농장에 대한 시료를 수집함
- 수동적 검색을 위해 검역본부로 의뢰되는 설사병관련 병성감정 시료와 돼지소모성질환 지도·지원사업관련 위축돈 시료를 수집함
2. PDCoV 단일 및 동시감별(PDCoV/PEDV/TGEV) 유전자진단법 확립
- 국내에는 표준화 PDCoV 유전자진단법이 없으므로 단일 conventional RT-PCR(cRT-PCR)과 real-time RT-PCR(qRT-PCR)을 개발하였고, PDCoV 뿐만 아니라 PEDV와 TGEV를 포함하는 돼지 coronavirus 3종(SECoV)을 동시에 감별 진단하기 위한 Multiplex qRT-PCR을 개발함
- SECoV 동시감별 qRT-PCR의 검출 한계를 조사한 결과, PDCoV, PEDV, TGEV 모두 10 copy 까지 검출이 가능하였으며, 외국 발표 qRT-PCR과 비교시, 동등 이상의 민감도를 보였음
- RotaV의 A, B, C group을 동시에 감별 진단할 수 있고, 국내 주요 RotaV G type인 3, 4, 5, 9 type을 동시에 감별 진단할 수 있는 Multiplex qRT-PCR을 각각 개발 진행중임
3. 수집 시료에 대한 PDCoV 검사 및 유병율 조사
- 능동적 검색으로 2년간 양돈수의사가 의뢰한 PDCoV 감염 의심농장 시료에 대한 PDCoV 검사 결과, 총 61농장중 16농장(26.2%), 294두중 24두(8.2%)에서 PDCoV가 검출됨
- 수동적 검색으로 2년간 병성감정 및 소모성질환 지도지원사업 시료에 대한 PDCoV 검색 결과, 설사 증상이 있는 돼지에서는 8.0%, 설사 증상이 없는 돼지에서는 1.2%의 양성률을 보임
- PDCoV 양성건중 PDCoV 단독감염이 약 55%로 조사되었고, Clostridium perfringens A형이 16.7%로 가장 많이 복합감염됨
4. 국내 발생 PDCoV의 유전학적 특성 분석
- 국내 PDCoV 11주의 유전자를 분석하여 외국주와 근연관계를 조사한 결과, 국내주 모두는 중국형 및 태국형 보다는 미국형에 가까움
- 국내 PDCoV간에는 nucleotide(nt)에서 98.9∼99.9%, amino acid(aa)에서 97.8∼99.9%의 상동성을 보임
◦제2세부과제명: 국내 발생 PDCoV의 병원성 조사
1. 공격접종용 바이러스 분리, 증폭 및 역가 확인
- PDCoV 양성 장조직 시료로부터 바이러스를 분리하여 단크론 항체를 이용한 특이적인 반응과 전자현미경으로 바이러스 입자를 확인함
- 3회 계대한 배양액의 역가는 5×107TCID50/0.1ml로 바이러스의 증식성이 양호함
2. PDCoV 공격접종을 통한 임상증상 및 폐사율 조사
- 5일령의 포유자돈에 대한 PDCoV 공격접종 시험 결과, 14일 동안 폐사는 유발되지 않았으며, 식욕저하는 일부 개체에서 단 기간에 관찰되었고, 구토 증상은 거의 없음
- 공격접종 2일째부터 고형물이 있는 액변이 관찰되기 시작하여 접종 3∼4일째 모든 개체는 수양성 설사 증상을 보였고, 접종 7∼9일째에는 다시 연변으로 전환됨
3. PDCoV 공격접종을 통한 바이러스 배출양상 및 병리조직학적 특성 조사
- 개체마다 차이는 있으나, 공격접종 3∼4일째에 분변을 통한 바이러스 배출량이 106.7∼106.8 copy로 가장 높았으며, 공격접종 8일째까지 103.0 copy의 바이러스를 배출함
- 공격접종 4일째 부검을 실시한 결과, 전형적인 바이러스 감염 소견이 관찰되었고, 위, 소장, 대장 및 장간막림프절에서 PDCoV가 검출되었으며, 14일째 부검한 돼지는 장 병변이 심하지 않았고, 십이지장에서만 낮은 PDCoV가 검출됨
- 공격접종 4일째 부검한 돼지에서는 주로 회장 부위의 융모 위축 및 탈락이 심하였고, 십이지장의 위축 및 탈락은 적었으며, 14일째 부검한 돼지의 십이지장과 회장에서 미약한 병변이 관찰됨
- 공격접종 4일째 부검한 돼지에서 주로 공장 및 회장 부위의 융모 상층부에 있는 enterocyte 세포질에서 PDCoV 항원이 IHC로 확인됨
(출처 : 연구결과 요약 2p)
Abstract
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Porcine deltacoronavirus (PDCoV) is a notable coronavirus that has been identified from pigs with diarrhea in the US since 2014 and is occurring in pig farms of many countries recently.
We investigated the prevalence of PDCoV infection in Korean pigs, the genetic characteristics of PDCoV isolates
Porcine deltacoronavirus (PDCoV) is a notable coronavirus that has been identified from pigs with diarrhea in the US since 2014 and is occurring in pig farms of many countries recently.
We investigated the prevalence of PDCoV infection in Korean pigs, the genetic characteristics of PDCoV isolates, and the pathogenicity of PDCoV isolate in suckling piglets. To examine the PDCoV quickly and accurately, we developed the real-time RT-PCR (qRT-PCR) that can test swine enteric coronavirus, such as porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), porcine transmissible gastroenteritis virus (TGEV) and PDCoV, at the same time. In a total of 61 diarrheal cases (294 pigs) received from pig veterinarians from March 2016 to October 2017, PDCoV was detected in 16 cases (24 pigs). Among 120 cases (225 pigs) submitted to APQA from January 2016 to October 2017, 12 cases (18 pigs) were positive for PDCoV. Of the PDCoV positive samples, Clostridium perfringens A was most frequently detected. The complete S genes obtained 11 samples were identified as 3,483 nucleotides (nt) in length. In addition, the complete M and N genes from 5 samples were composed of 653 and 1,028 nt, respectively. The phylogenetic analysisshowed the Korean strains were more similar to US strains than Chinese and Thailand strains. The S genes including 11 strains in this study and other Korean strains were homologous, showing 99.4-99.9 % nt and 99.2-100 % amino acid (aa) identity. The phylogenetic results of the M and N genes were similar to those of the S genes. To evaluate the pathogenicity of PDCoV strain KORDR14-22 that were isolated from a suckling piglet with diarrhea in 2016 and genetically more similar to US strains than Chinese and Thailand strains, four 5-day-old piglets were orally inoculated with 5ml of tissue-culture-grown PDCoV isolate at passage 3 (a titer of 107TCID50/ml). All challenged piglets showed watery diarrhea at 1-2 days post-inoculation (DPI). The progression of diarrhea was most severe at 4–7 DPI and the piglets gradually recovered thereafter. Despite the diarrhea accompanied by appetite loss, no mortality occurred during the study. PDCoV was detected in feces of all challenged piglet at 1 DPI. PDCoV RNA quantity reached a peak at 2–4 DPI and persisted until 8 DPI. PDCoV RNA was detected in stomach, intestine and mesenteric lymph node of 2 challenged piglets at 4 DPI necropsies with high quantities in jejunums and ileums. In 2 challenged piglets at 14 DPI necropsies, PDCoV were rarely detected in the feces. The small intestines, ceca and colons were clearly transparent, thin-walled, gas-distended and yellow watery contents had accumulated in them in the challenged piglets at 4 DPI necropsies. Mild intestinal lesions consistent with viral enteritis were observed in the challenged piglets at necropsy at 14 DPI. The severe villous atrophy was apparent in the small intestines, especially in the jejunum and ileum, in the challenged piglets at 4 DPI necropsies. In Korea, PDCoV infected pig farms were 26.2 % in active surveillance and 10 % in passive surveillance. In addition, the positive rate of PDCoV infected pigs were 8 %, suggesting that PDCoV remains the important causative agent of piglet diarrhea diseases. PDCoV isolated in Korea caused transiently moderate and severe diarrhea, shed virus in rectal swabs, and developed macroscopic and microscopic lesions in small intestines. However, PDCoV could not cause mortalities with lasting diarrhea and dehydration in neonatal piglets, indicating that PDCoV infection appears to be less severe than porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) infection.
(출처 : 영문초록 42p)
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 농림축산검역검사기술개발 연구과제 최종결과보고서 Final Report (FR) ... 2
- Ⅰ. 연구배경 및 목표 ... 4
- 1. 연구배경 ... 4
- 2. 연구최종목표 ... 5
- 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 6
- Ⅱ. 연구방법 및 수행전략 ... 7
- 1. 재 료 ... 7
- 2. 연구전략 및 방법 ... 7
- Ⅲ. 연구결과 ... 9
- 1. 제1세부과제명: 국내 PDCoV의 감염실태 및 특성 조사 ... 9
- 2. 제2세부과제명: 국내 발생 PDCoV의 병원성 조사 ... 26
- Ⅳ. 연구결과요약 ... 36
- 1. 국내 양돈장의 PDCoV 검사체계 구축 및 감염상황 감시 ... 36
- 2. PDCoV 단일 및 동시감별 유전자진단법 확립 ... 36
- 3. 수집 시료에 대한 PDCoV 검사 및 유병율 조사 ... 36
- 4. 국내 발생 PDCoV의 유전학적 특성 분석 ... 36
- 5. 국내 발생 PDCoV의 병원성 조사를 위한 시료 확보 ... 37
- 6. 공격접종용 바이러스 분리, 증폭 및 역가 확인 ... 37
- 7. PDCoV 공격접종을 통한 임상증상 및 폐사율 조사 ... 37
- 8. PDCoV 공격접종을 통한 바이러스 배출양상 및 병리조직학적 특성 조사 ... 37
- Ⅴ. 고 찰 ... 38
- Ⅵ. 연구사업 추진상 문제점 및 건의사항 ... 40
- Ⅶ. 주요연구과제 변경사항 ... 40
- Ⅷ. 참고자료 ... 40
- IX. 영문초록 ... 42
- 끝페이지 ... 43
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