초록 ▼

노로바이러스는 수인성·식품매개 식중독의 중요한 원인체로 바이러스에 오염된 음용수, 식품, 환경표면 등을 통해 구강경로로 전파된다. 본 연구에서는 현재 식중독원인조사에 사용하는 노로바이러스 시험방법을 평가 및 개선하는 한편 노로바이러스 오염 우려가 높은 다양한 식품에 대한 노로바이러스 시험법을 마련하고자 하였다. 시험법 개선을 위하여 최신 노로바이러스 검출법에 대한 다양한 문헌 자료를 수집하였으며, 검사 대상 식품을 확대하기 위해 노로바이러스 식중독 원인식품 정보, 집단 급식소 제공 식단 등의 정보를 이용하여 최종적으로 17종의 식품

노로바이러스는 수인성·식품매개 식중독의 중요한 원인체로 바이러스에 오염된 음용수, 식품, 환경표면 등을 통해 구강경로로 전파된다. 본 연구에서는 현재 식중독원인조사에 사용하는 노로바이러스 시험방법을 평가 및 개선하는 한편 노로바이러스 오염 우려가 높은 다양한 식품에 대한 노로바이러스 시험법을 마련하고자 하였다. 시험법 개선을 위하여 최신 노로바이러스 검출법에 대한 다양한 문헌 자료를 수집하였으며, 검사 대상 식품을 확대하기 위해 노로바이러스 식중독 원인식품 정보, 집단 급식소 제공 식단 등의 정보를 이용하여 최종적으로 17종의 식품을 선정하였다. 식품에서 노로바이러스를 검출하는 일반적인 과정은 회수, 농축, 유전자추출, 유전자 증폭 단계로 구분할 수 있다. 본 연구에서는 식품에서 노로바이러스의 회수및 농축 방법을 개선하는데 집중하였다. 바이러스의 회수 효율을 측정하기 위해서는 뮤린 노로바이러스를 사용하였다. 각 시료에 뮤린 노로바이러스를 5x10⁴-10⁶copies/g의 농도로 무균작업대에서 인위적으로 오염시킨 후 이전에 문헌 보고된 다양한 회수방법과 농축방법을 적용하였다. 인위적으로 오염시킨 시료로부터 바이러스를 회수하기 위한 버퍼는 Threonine, TGBE(Tris HCl, glycine, beef extract), Glycine, PBS를 사용하였으며 농축방법으로는 PEG(Polyethylene glycol) 분자량 8,000과 20,000을 농축용액으로 사용하였다. 시험법 1은 현재 식중독 원인조사에 활용 중인 PEG 농축 법을 일부 변경하여 회수율을 향상시키고자 노력하였다. 시험법 2는 식품에서 바이러스를 검출하기 위한 ISO 15216-2(2013) 방법을 적용하였다. 시험법 3은 TRIzol을 처리하여 바이러스를 회수한 후 Chloroform : Isoamyl alcohol (24:1) 혼합액을 사용해 정제하고 Isopropanol을 이용해 침전하는 방법을 사용하였다. 시험법 4는 cotton swab을 사용해 시료의 표면에서 바이러스를 회수한 뒤 PBS를 이용해 바이러스를 추출하였다. 시험법 5는 바이러스가 오염된 식품에서 바이러스를 회수한 후 Stomacher bag 여과, 0.45㎛ syringe filter 여과, 0.2 ㎛ syringe filter 여과를 차례로 거쳐 Vivaspin 20 UF를 이용해 바이러스를 농축하였다. 모든 농축된 시료는 RNA 추출 후 Realtime RT-PCR을 이용해 노로바이러스를 검출하였으며 회수율은 Realtime RT-PCR Standard RNA를 증폭에 사용하여 측정하였다. 대상식품에 각 시험법을 적용하여 회수율을 비교·분석한 결과, 식품별 가장 높은 회수율을 보였던 최적의 조합은 상추는 TGBE-PEG 8,000에서 52.7%, 배추는 TGBE-ultrafiltration 방법에서 38.3%, 양파는 TRIzol 방법에서 32.3%, 오이는 TGBE-PEG 8,000에서 66.4%, 방울토마토는 TGBE-PEG 8,000에서 62.1%, 사과는 TGBE-ultrafiltration에서 59.2% 및 TGBE-PEG 20,000에서 57%, 포도는 TGBE—PEG 20,000에서 71.7%, 딸기는 TGBE-Pectinase-ultrafiltration에서 24.2%, 깻잎지는 TRIzol에서 68.9%, 단무지는 TRIzol에서 70.0%, 연어는 PBS에서 71.9% 김은 PBS-PEG 8,000에서 72.8%, 샌드위치는 Threonine-ultrafiltration에서 37%, 샐러드는 TGBE-ultrafiltration에서 38.4%, 달걀(반숙)은 TGBE-ultrafiltration에서 54.8%, 소고기 육회는 Glycine에서 57.3%, 김밥은 TGBE-ultrafiltration에서 75.9%, TGBE-PEG 8,000에서 75.2%로 확인되었다. 결과적으로 현재의 노로바이러스 시험법 보다 검출효율과 민감도가 향상된 시험법을 마련하였으며, 식품용수(지하수), 어패류(굴), 김치류, 딸기, 오이, 샌드위치에 대한 시험법 동영상을 제작하였다. 본 연구를 통해 확립된 시험법은 식중독원인조사와 오염원 추적에 활용될 것이다.

(출처 : 요약문 2p)

Abstract ▼

Noroviruses(NoVs) are important pathogenic viruses that cause food_borne and water_borne gastroenteritis outbreaks. Transmissions of NoVs occurs primarily via the fecal oral route and consumption of contaminated water, environmental surface and foods. The goal of this study was to evaluate the curre

Noroviruses(NoVs) are important pathogenic viruses that cause food_borne and water_borne gastroenteritis outbreaks. Transmissions of NoVs occurs primarily via the fecal oral route and consumption of contaminated water, environmental surface and foods. The goal of this study was to evaluate the current method used for NoV foodborne investigation and to develop the detection method for NoV from various foods. To improve the detection methods, we collected published papers relate to detecting NoVs in foods. We are also confirmed 17 kinds of food using the information on cause food linked to NoV outbreaks and the menu of catering company to expand the experiment foods for food_borne investigation. The general testing procedure of the NoVs in foods can be divided into four steps : elution, concentration, nucleic acid extraction and PCR amplification. We focused on optimizing two steps for methods improvement that are elution buffer and concentration methods. A seeding experiment with Murine NoV was conducted to determine the efficiency of each virus extraction procedure. We were seeded by direct application of 5x10⁴-10⁶copies/g for Murine NoVs and allowed to dry virus in a laminar flow hood. Viral elution methods were applied as previously reported methods and modified methods. The artificially contaminated foods were eluted the viruses using Threonine, TGBE(Tris HCl, glycine, beef extract), Glycine and PBS.
For the virus concentration, we used PEG 8,000 and 20,000. The detailed procedure was as follow. Method 1 was modified PEG precipitation in the method currently used for NoV foodborne investigation. Methods 2 was described in the ISO 15216-2(2013) for detecting viruses in foods. Methods 3 is added Chloroform : Isoamyl alcohol(24:1) mixture after TRIzol treatment and then Isopropanol was added. Methods 4 was eluted using PBS after surface wiping by cotton swab. The fifth methods, we harvested the NoVs using stomacher bag-0.45 ㎛ syringe filter-0.2 ㎛, syringe filter after recovering NoVs in the artificial contaminated samples and then we concentrated the viruses through Vivaspin 20. All concentrate samples are used to extract viral RNA a QIAamp Viral RNA Mini kit according to the manufacturer’s instruction. Each sample was confirmed by one-step realtime RT-PCR. The recovery rate of all methods was evaluated by quantification using NoV standard RNA. The result of the recovery in optimized methods was as below.
The recovery rate of each sample was 52.7% for lettuce by TGBE-PEG 8,000, 38.3% for cabbage by TGBE-ultrafiltration, 32.3% for onion by TRIzol, 66.4% for cucumber by TGBE-PEG 8,000, 62.1% for tomato by TGBE-PEG 8,000, 59.2% for apple by TGBE-ultrafiltration, 71.7% for grape by TGBE—PEG 20,000, 24.2% for strawberry by TGBE-Pectinase-ultrafiltration, 68.9% for sesame leaves in soy sauce by TRIzol, 70% for pickled radish by TRIzol, 71.9% for salmon by PBS, 72.8% for laver by PBS-PEG 8,000, 37% for sandwich by Threonine-ultrafiltration, 38.4% for salad by TGBE-ultrafiltration, 54.8% for a half-boiled egg by TGBE-ultrafiltration, and 57.3% for raw beef by PBS, 75.9%, 75.2% for Kimbab by TGBE-ultrafiltration and TGBE-PEG, respectively. Finally, we confirmed more sensitivity and effective to detection NoVs than current detection methods and made a video for these samples that groundwater, oyster, Kimchi, strawberry, cucumber and sandwich. The products of this study could assist to trace the NoV outbreaks and to identify the possible source of NoV contamination.

(출처 : Summary 5p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 국문 요약문 ... 2
• Summary ... 4
• 목차 ... 7
• 그림목차 ... 8
• 표목차 ... 11
• 연구개발과제 연구결과 ... 13
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 13
• 제 2 장 연구개발과제의 국내·외 연구개발 현황 ... 22
• 제 3 장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과 ... 24
• 제4장 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 101
• 제5장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 103
• 제6장 연구개발과제의 연구개발 결과 활용계획 ... 105
• 제7장 참고문헌 ... 106
• 끝페이지 ... 111