초록 ▼

과거의 암 연구에서는 암 세포 자체에만 집중하였기에 암세포 외 주변 세포 등은 관심의 대상이 아니었다. 그러나 암세포가 주변 세포 및 세포외 기질과 같은 암 미세환경을 이용하여 체내의 면역기전을 회피하고, 암 미세환경이 항암 치료를 어렵게 만드는 데 크게 기여한다는 여러 연구 결과에 의해 최근에는 암 미세환경을 활용하여 암을 극복하고자 하는 노력들이 이뤄지고 있다.

본 과제는 암을 암세포와 암 미세환경 복합체로 보는 패러다임의 변화에 상응하여 수행된 항암제 안전관리를 위한 기반 연구로서, 여러 암에서 항암제 내성과 관련

과거의 암 연구에서는 암 세포 자체에만 집중하였기에 암세포 외 주변 세포 등은 관심의 대상이 아니었다. 그러나 암세포가 주변 세포 및 세포외 기질과 같은 암 미세환경을 이용하여 체내의 면역기전을 회피하고, 암 미세환경이 항암 치료를 어렵게 만드는 데 크게 기여한다는 여러 연구 결과에 의해 최근에는 암 미세환경을 활용하여 암을 극복하고자 하는 노력들이 이뤄지고 있다.

본 과제는 암을 암세포와 암 미세환경 복합체로 보는 패러다임의 변화에 상응하여 수행된 항암제 안전관리를 위한 기반 연구로서, 여러 암에서 항암제 내성과 관련하여 중요성이 보고되고 있는 대표적인 암 미세환경 요소인 암연관 섬유아세포(cancer-associated fibroblast, CAF) 기반의 항암제 내성 평가 플랫폼을 마련하고자 하였다. 또한 구축한 플랫폼을 이용한 in vitro 실험결과와 환자의 임상정보를 통합하여 대장암 환자 유래 CAF에 대한 전사체 발현 분석을 수행하였고, 이를 토대로 CAF 기반의 항암제 내성 관련 생체지표를 찾고자 하였다.

전사체 발현 분석 및 in vitro 실험에 사용하기 위해 11명의 대장암 환자로부터 총 11쌍의 CAF, NF를 확보하고 해당 환자들에 대한 임상정보를 수집하였다. 또한 matrigel을 이용한 3D 배양 기법을 이용하여 9개의 환자 유래 대장암 오가노이드를 구축하였고, 이에 대한 SOP를 마련하였다. 확보된 CAF와 NF에 대해 NGS의 일종인 mRNA sequencing을 수행하였으며, 이를 기반으로 유전자 발현 분석을 수행하였다. In vitro 실험에는 11개의 CAF conditioned medium(CM)을 수집하여 이용하였다. 대장암 세포주 LoVo와 본 연구에서 구축한 대장암 오가노이드를 대상으로 CAF CM을 처리하여 대장암 환자의 1차 치료제로 사용되는 5- fluorouracil(5-FU)에 대한 세포의 viability 변화를 관찰하였다. 인간 대장암 세포주 LoVo를 이용하여 항암제 내성과 관련하여 6개의 CAF (항암제 내성 유발 가능성을 보인 4개의 CAF와 대조군 대비 더 취약한 생존을 보인 2개의 CAF)를 우선 선별하였다. 흥미롭게도 LoVo에서는 6개의 CAF 중 4개의 CAF CM에서 항암제 내성 유발 효과가 나타난 것과 달리 대장암 오가노이드에서는 6개의 CAF CM 모두 항암제 내성 유발 효과가 나타난 것을 확인할 수 있었다.

In vitro 실험 결과와 환자의 1차 임상 정보 및 1차 항암치료 결과를 반영하여 CAF의 전사체 분석을 수행하였다. LoVo와 대장암 오가노이드 모두에서 가장 높게 항암제 내성을 유발하는 것으로 나타난 군(CAF 6, 9)과 가장 낮은 생존을 보인 군(CAF 3, 14)을 분류하였고, 두 군 사이의 유전자 발현차이를 비교하였다. 그 결과 p-value 기준 상위 40개의 유전자 중 24개의 유전자가 종양 관련 유전자로 나타났으며, 이 중 18개의 유전자가 그 기능과 상응하게 발현되고 있는 것으로 나타났다. 임상적 진단 소견이 비슷함에도 불구하고 상반된 항암치료 효과를 보인 두 환자의 CAF(CAF 7, 15)에 대한 DEG 분석 결과에서는 p-value 기준 상위 40개의 유전자 중 17개의 유전자가 종양 관련 유전자로 나타났다. 이 중 6개의 유전자가 그 기능과 상응하는 발현 양상을 보이고 있음을 확인할 수 있었다. 결과적으로 두 가지 분석을 종합하였을 때, CXCL14와 RSPO2 가 공통적으로 나타나고 있는 차등 발현 유전자임을 확인할 수 있었다. 이에 본 연구에서는 이 두 유전자가 항암제 내성 유발 CAF를 평가하는 데 있어 지표가 될 수 있는 후보유전자가 될 수 있음을 제시한다.

위의 분석 결과와 더불어 유일하게 항암치료 효과가 나타나지 않은 환자의 CAF 15의 경우 군집 분석 시 단독으로 군을 형성하며 분류되는 것을 확인할 수 있었고, 병리조직학적 소견상 암세포 주변에 CAF게 상대적으로 높게 분포하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 환자의 항암제 반응 예측 시 CAF에 대한 평가가 중요하게 반영될 수 있다는 것을 보여줄 수 있는 부분이라 생각된다.

최종적으로 본 연구의 결과를 통해 암 오가노이드(3D 배양)와 암세포주(2D 배양)에서의 CAF에 의한 항암제 반응 차이를 확인하였고, 이는 과거의 2D 기반 약물 평가 시스템으로는 한계가 있을 수 있으며 암 오가노이드를 포함한 3D 배양으로의 확대를 통해 환자별 약물 평가기술의 마련이 필요할 수 있음을 시사하였다. 또한 in vitro 실험 결과와 임상정보를 반영한 발현 분석을 통해 CAF의 항암제 내성 유발 효과를 평가하는데 있어 의미있는 두 개의 유전자 후보를 발굴하였다. 따라서 본 과제를 통해 확보된 환자 맟춤형 암 미세환경 평가 플랫폼과 내성 관련 CAF 유전자의 발굴은 항암제 적정사용(안전관리)을 위한 정밀의료 구현에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

(출처 : 요약문 2p)

Abstract ▼

The tumor microenvironment, which has been the object of elimination for the purpose of increasing tumor purity in cancer research, is now considered to be an important factor in the mechanisms related to cancer including anticancer resistance. In this study, we conducted a research on the anticance

The tumor microenvironment, which has been the object of elimination for the purpose of increasing tumor purity in cancer research, is now considered to be an important factor in the mechanisms related to cancer including anticancer resistance. In this study, we conducted a research on the anticancer drug resistance mechanism by cancer-associated fibroblast(CAF).

As a result of the Next Generation Sequencing(NGS) of CAFs derived from colorectal cancer patients, an attempt was made to find out CAF-based biomarkers that change anticancer drug responses in colorectal cancer by integrating in vitro experimental data and patients’ clinical information. 11 pairs of CAF and NF were obtained from 11 patients of colorectal cancer and mRNA sequencing was performed on each of them. In addition, when 5- fluorouracil(5-FU) was treated on cancer cell lines and tumoroids derived from colorectal cancer patients, we observed the viability of cancer cells making use of CAF conditioned medium(CM). Cancer cells’ responses to 5-FU showed differences in each treated CAF CM. Even if CAF CM is the same, there are some cases where some differences were found in colorectal cancer cell lines and the tumoroids derived from patients. Based on the in vitro experiments and clinical data of patients, we suggested CXCL14 and RSPO2 could be related to the resistance of 5-FU by CAF. Interestingly, in patients who failed in anticancer treatment, when an transcriptome (clustering) analysis was done on CAFs, a phenomenon of being separately has been shown. Also overwhelmingly massive existence of CAFs around cancer cells was observed in the histopathology opinion of the patients. These results suggest that an evaluation of CAFs is important when we predict patients’ responses to anticancer drug in colorectal cancer.

(출처 : Summary 5p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 국문 요약문 ... 2
• Summary ... 5
• 목차 ... 7
• 연구개발과제 연구결과 ... 8
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 8
• 제2장 총괄연구개발과제의 국내･외 연구개발 현황 ... 12
• 제3장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과 ... 17
• 제4장 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 114
• 제5장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 119
• 제6장 연구개발과제의 연구개발 결과 활용계획 ... 120
• 제7장 참고문헌 ... 121
• 제8장 첨부 서류 ... 138
• 끝페이지 ... 179