[보고서]멀티플렉스 오믹스 데이터 분석 및 바이오시스템 네트워크 분석을 위한 시스템생물학 기술 개발

윤성호

[국가R&D연구보고서] 멀티플렉스 오믹스 데이터 분석 및 바이오시스템 네트워크 분석을 위한 시스템생물학 기술 개발
Development of systems biology knowledgebase for analyses of multiplex omics data and biosystem networks 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	건국대학교 KonKuk University
연구책임자	윤성호
참여연구자	김신연 , 김한설 , 이동주 , 김영신
보고서유형	2단계보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2018-03
과제시작연도	2017
주관부처	과학기술정보통신부 Ministry of Science and ICT
연구관리전문기관	한국연구재단 National Research Foundation of Korea
등록번호	TRKO201900022516
과제고유번호	1711056664
사업명	기후변화대응기술개발
DB 구축일자	2020-07-29
키워드	바이오리파이너리.시스템생물학.시스템대사공학.멀티플렉스 오믹스.세포내 네트워크 모델링.Biorefinery.Systems biology.Systems metabolic engineering.Mutiplex omics.Cellular network modeling.

초록 ▼

ㅇ 생체부품목록 예측기술과 멀티플렉스 오믹스 데이터의 통합분석 기술 개발
ㅇ E. coli BL21(DE3)의 유전체 재주석화(re-annotation)와 transcriptome map 작성
ㅇ E. coli BL21(DE3) 오믹스 데이터 확보 및 분석: 전사체(18건), 표현체(2건)
ㅇ 방향성 있는 생체네트워크 내 정보 흐름을 고려하여 네트워크 모듈 분석법 고안
ㅇ 기능미상 유전자 (ybeD)를 이용한 고온생장 플랫폼 숙주균 개발
ㅇ 생산시기와 발현량을 정확히 조절하고, 다양한 대장균 숙주에 적용가능한 단백질 발현시스템 개발
ㅇ 생물시스템 전체의 대사 네트워크와 조절 네트워크가 통합된 다양한 수학적, 전산적 기법 분석
ㅇ 방향성 있는 생체네트워크 내에서 연결이 많지 않은 subnetwork에서 중요한 노드를 탐지할 수 있는 새로운 centrality measure 개발
ㅇ 최신의 유전체 주석과 전사체 데이터를 기반으로 E. coli BL21(DE3)의 대사네트워크 모델 개발

(출처 : 보고서 요약서 3p)

Abstract ▼

Ⅱ. Research purpose
Being fueled by rapid development of high-throughput multiplex omics technoloies and genome engineering tools, integration of multiple omics data and in silico modeling and simulation of biological networks thereby is becoming critical to design and re-engineer microorganisms for the efficient industrial production of recombinant proteins, biofuels, and a variety of bioproducts. As a platform technology for systems metabolic engineering to produce biorefinery, we aim to develop systems biology knowledgebase system for analyses of multiplex omics data and biosystem networks.

Ⅲ. Research contents
❍ Analysis of biological parts list of biorefinery platform strain
- Genome re-annotation of E. coli BL21(DE3) by integrated analysis of multiple genome automated pipelines and transcriptome structure analysis
❍ Collection of omics data to develop a network model of the bio-refinery strain
- Transcriptome data (18 ea) & phenome data (2 ea)
❍ Identification of gene candidates for the platform strain development
- Development of module detection algorithm in complex bio-networks and its application to the analysis of metabolic network in E. coli.
❍ Development of platform strain for the analysis of omics and biological network
- Development of high-temperature resistant microorganism overexpressing YbeD protein and method for culturing of high-temperature resistant microorganism
- Developed an E. coli inducible expression system for membrane protein production based on titrated expression of a mutant lac repressor
❍ Establishment of integrated transcriptional and metabolic network model
- Analysis of modeling approaches for the integrated transcriptional and metabolic network
- Development of a novel measure (cascade number) to determine the status of local connectivity between entities in directed biochemical networks, and application of cascade number to analysis of the metabolic reaction network of E. coli K-12
❍ Construction of genome-scale metabolic network of E. coli BL21(DE3)
- Involvement of 1342 genes, 1833 metabolites, and 2603 metabolic reactions
- Comparison of simulation results from the developed model and phenotype microarray tests
❍ Achievements
- 4 papers published: Nucleic Acids Research (2017, IF 10.162), ACS Synthetic Biology (2017, IF 5.382), J. Microbiol. Biotechnol. (2017, IF 1.750), IEEE Transactions on Computational Intelligence and AI in Games (2017, IF 1.113)
- 1 Korean patent: appl. 10-2018-0009345
- 11 Conference presentation: 7 invited talk & 4 poster presentation

IV. Expected contribution
The systems metabolic engineering platform technology will reduce time and labor significantly to produce biorefinery products such as biopolymers and key chemical products. The developed techniques for processing and integration of multiplex omics data and modeling/simulation of biological networks can be applied to complex biosystems such as plant and animal

(출처 : SUMMARY 7p)

목차 Contents

표지 ... 1
제 출 문 ... 2
보고서 요약서 ... 3
요 약 문 ... 4
SUMMARY ... 7
CONTENTS ... 9
목차 ... 10
제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 11
제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 12
제 1 절 국외 연구 현황 ... 12
제 2 절 국내 연구 현황 ... 16
제 3 절 본연구진의 관련연구 현황 ... 17
제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 18
제 1 절 오믹스 기반 생체부품목록 예측기술 확립 ... 18
제 2 절 바이오리파이너리 생산균주의 네트워크 모델 개발을 위한 오믹스 데이터 확보 ... 28
제 3 절 시스템대사공학 균주개발을 위한 유용인자 발굴 ... 45
제 4 절 오믹스/네트워크 분석을 통한 플랫폼 숙주균 개발 ... 48
제 5 절 인실리코 조절 및 대사 네트워크 통합 모델링 기법 확립 ... 64
제 6 절 바이오리파이너리 생산균주의 인실리코 조절 및 대사 네트워크 모델 개발 ... 81
제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 88
제 1 절 연구개발목표의 달성도 ... 88
제 2 절 평가의 착안점에 따른 목표달성도에 대한 자체평가 ... 89
제 3 절 관련분야 기술 발전에의 기여도 ... 94
제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 96
제 6 장 참고문헌 ... 98
끝페이지 ... 102

표/그림 (63)

표 대사경로 최적화를 위한 부품과 파이프 (A) 합성생물학에서는 대사흐름을 제어하기 위하여 전사요소(transcription machinery), 대사효소 유전자의 프로모터, ribosome binding site(RBS), 번역 요소 (translation machinery)를 정밀 조절할 수 있는 부품을 개발한다. (B) 대사공학에서는 이러한 합성생물학 부품을 이용하여 최종생산물질로의 대사흐름을 최대화할 수 있도록 파이프를 구성한다. 일반적으로 이러한 파이프에서는 중간 단계의 효소 발현량을 증가시키고, 중간 대사산물의 축적은 감소시킨다. [Image from (Boyle and Silver 2012)]
표 다변수 모듈화 기법 (Multivariate modular metabolic engineering , MMME)을 이용한 taxadien 생산의 최적화 (a) glucose에서 taxadiene에 이르는 MEP 경로를 upstream module (G3P와 pyruvate부터 DMAPP와 IPP까지)와 downstream module (DMAPP와 IPP 부터 Taxadiene)의 두개로 모듈화하고, 관련 유전자를 오페론으로 구조화함. (b) 각 오페론의 발현을 프로모터 세기와 플라스미드 복제 수로 조합하여 최적의 taxadiene 생산량을 얻음. [Image from (Yadav et al., 2012)]
표 대장균에서의 대사회로 모듈화를 통한 말라리아 치료제 전구물질 (artemisinic acid)의 생산 [Image from (Keasling, 2012)]
표 Quality assessment of RNA samples isolated by each method
표 Procedure of directly labeling of total RNA
표 Scanned image of a tiling array
표 전사개시위치 결정을 위한 differential RNA sequencing
표 Examples of dynamic changes in transcriptome structure of E. coli BL21(DE3). Five tiling array data were plotted against coordinates on the genome using the Gaggle Genome Browser. Genes in the forward and reverse strands are shown in yellow and orange, respectively. Corresponding expression intensity data were aligned above forward strand genes and below reverse strand genes
표 오믹스 기반 생체부품목록 예측
표 유전체 및 전사체 통합 분석 과정
표 Annotation pipeline에 따른 E. coli BL21(DE3) 주석화 비교
표 산업 대장균의 신규 유전자 규명 및 전사체맵 완성 과정. Annotated features and tiling array data were plotted against genome coordinates (13.6 kb genomic region from 3,953,400 to 3,967,000) using a genome browser. This example showcases the value of strand-specific transcriptome analysis. Genes in the forward and reverse strands (1) are denoted in yellow and orange, respectively. Corresponding transcriptome data are aligned above the forward strand and below the reverse strand. The black bars (2) denote significantly expressed probes (FDR < 0.01). Dots (3) represent the normalized probe intensities on a log2 scale at the corresponding genomic location for samples from LB media (cell density of 0.24 in OD600 is colored red, 1.54 orange, 5 yellow) and MR media (1.5 is colored green, 14 blue). The heat map (4) shows transcript level changes (log2 scale) of four samples against a reference sample from MR media (1.5 in OD600) (red is upregulated; green downregulated). In the gene panel, newly identified features are shown in light gray. These included non-coding RNAs (5), ORFs (6), repetitive extra-genic palindrome elements (7) and 5 untranslated regions (8)
표 Examples of dynamic changes in the transcriptome structure of E. coli BL21(DE3). Discovery of small regulatory RNAs (sRNAs) that are trans-encoded (A), cis-encoded (B), anda putative novel gene (C). Correction of a translation initiation site (D). Expression of gene clusters of the glyoxylate shunt (E), secondary type II secretion system (F), and amino acid biosynthesis (G)
표 Time profiles of the concentrations of cell (○), acetic acid (▲), and glucose (■) during batch cultures of E. coli BL21(DE3) in LB medium (left) and defined medium (Right). Filled red circles are the sampling points for transcriptome analyses
표 Functional enrichment of differentially expressed genes at exponential and stationary phases in complex LB media and minimal MR media. Genes which were highly expressed in LB, MR, and both media were categorized by clusters of orthologous groups (COGs). Left grouped bars are for genes highly expressed at exponential growth phase, and right for those at stationary phase
표 E. coli BL21(DE3) 연속배양에서의 열처리 (37℃ → 42℃)
표 Differentially expressed genes (DEGs) during temporal heatshock-responsive stages. The mRNA log2 ratios of time series data were normalized to a sample from pre-perturbation (-30 min before the temperature upshift). (A) Heatmap of the transcript ratios which were grouped according to time periods with member genes as rows and sampling time points as columns. Above the heat map, clustering of sampling time points are shown for early (E), middle (M), and late (L) periods. (B) Ven diagram of DEGs identified in the different time periods. (C) Time profiles of averaged transcript ratios of the member genes
표 Examples of temporal dynamics of differentially expressed genes during early, middle, and late stages. The tiling array data were plotted against coordinates on the genome using a Gaggle Genome Browser. Genes in the forward and reverse strands are represented in yellow and orange, respectively. Corresponding transcriptome architecture data are aligned above forward strand genes and below reverse strand genes. Dots represent probe intensity (log2 scale) at the corresponding genomic location for samples from samples at 30 min before the temperature increase and after the 2 min, 10 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, and 40 h (red vertical arrow). The heat map denotes transcript level changes (log2 scale) at nine time points under the chemostat culture relative to transcript intensity at 30 min before the perturbation. (green is down-regulated; red up-regulated). (A) Early_middle_late.low: Flagellar biosynthesis. (B) Early.high: heatshock proteins. (C) Early_middle.high: methionine biosynthesis. (D) Middle_late.high: phage-shock protein. (E) Late.high: (a) iron metabolism, (b) capsular polysaccharides biosynthesis
표 열처리 반응 동안 시간에 따른 sigma factor 유전자 발현 패턴
표 조상 및 진화 대장균 균주의 생장. 부탄올 첨가 전 조상균주에 대해서는 A0, 진화 균주에 대해서는 E0이라 표시하였음. 부탄올 첨가 30 분 후 조상균주는 A1, 진화균주는 E1으로 표시하였음
표 Phenotype microarray (PM) 실험결과. 빨간색은 진화균주의 생장곡선을, 녹색은 조상균주의 생장곡선을 나타내며, 노한색은 두 균주에서의 공통생장면적을 나타냄. 각 PM plate 다음과 같은 96종의 다양한 기질 또는 생장환경을 제공함: carbon (PM1 and PM2), nitrogen (PM3), phosphorus and sulphur (PM4), auxotrophic supplement (PM5 to PM8), salt (PM9), pH stress (PM10), and inhibitory compounds such as antibiotics, antimetabolites, and other inhibitors (PM11 to PM20)
표 조상균주와 진화균주의 부탄올 처리 전후의 전사체 발현 변화
표 조상균주와 진화균주의 부탄올 처리 전후의 대사회로 관련 유전자 발현량 변화 비교. 각 그래프에서 왼쪽은 조상균주, 오른쪽은 진화균주의 유전자 발현량을 나타냄
표 단백질 상호작용 네트워크와 부탄올 처리 전후의 발현량
표 진화 균주에서 일어난 돌연변이 유전자와 부탄올 처리전후의 발현량 변화
표 모듈 간 연결의 성김성(sparseness)을 측정하는 방법
표 대사반응 네트워크 재구성법
표 E. coli core 모델에서 방향을 고려한 대사반응 네트워크의 모듈 분할 (왼쪽) Modularity 적용 (오른쪽) Infomap 적용
표 E. coli core 모델 대사반응 네트워크의 모듈 간 관계 측정
표 대장균을 고온시 유전자 발현량 변화 a. ybeD b. 대표적인 heat shock protein (groESL, dnaKJ, hslVU, ibpAB)
표 ybeD 결손 대장균주의 제작 과정
표 ybeD 과발현 pAR-ybeD 플라스미드
표 고온생장에 필요한 유전자들의 생장 비교
표 액체 배지에서 배양했을 때 ybeD 결손 또는 과발현에 따른 균체의 생장 곡선 (A) 37℃ 배양 (B) 46℃ 배양
표 고체 배지에서 배양했을 때 ybeD 결손 또는 과발현에 따른 콜로니 형성 (A) 37℃ 배양 (B) 46℃ 배양
표 ksp 오페론 유전자를 제거한 균주의 생장비교
표 LacI 변이 유전자(mlacI)의 발현 정도를 람노스 프로모터 (PrhaBAD)에 의해 배지에 넣어준 람노스 농도에 의해 조절함으로써 목적 단백질의 발현을 조절하는 시스템 개요도
표 본 연구에서 사용한 균주 및 플라스미드
표 Construction of a tunable mLacI inducible expression system. (A) Plasmid map of pAR-mLacI and a compatible pET plasmid of E. coli. In the pAR-mLacI plasmid, mlacI was placed under the control of PrhaBAD on the low-copy plasmid pACYCDuet-1 carrying the p15A replicon, which is fully compatible with a variety of T7 promoter-based pET plasmids containing a ColE1 or pMB1 origin. (B) Fluorescence reporter plasmids. gfp was inserted into two different plasmids, a high-copy plasmid (pMW7) under control of the T7 promoter and T7 RNAP (pMW-GFP) and a medium-copy plasmid (pMAL-c2X) using the tac promoter and E. coli RNAP (pMH-GFP). Note that pMW-GFP does not have lacO downstream of the promoter, whereas pMH-GFP does
표 Tunable expression of GFP from the pMW-GFP plasmid by the mLacI inducible system. (A) Schematic representation of the mLacI inducible system for expression of a target gene from a T7 promoter-based and lacO-free plasmid. pAR-mLacI or pAR-wtLacI were transformed into E. coli BL21(DE3) harboring pMW-GFP. Kinetic analysis of Lrhamnose dose-dependent GFP expression and growth of cells containing pAR-wtLacI (B) or pAR-mLacI (C). E. coli BL21(DE3) was used as control. The error bar denotes the standard deviation of the mean from the three replicates
표 Tunable expression of GFP from the pMH-GFP plasmid by the mLacI inducible system. (A) Schematic representation of the mLacI inducible system for expression of a target gene from a tac promoter and lacO-based plasmid. pAR-mLacI or pAR-wtLacI were transformed into E. coli BL21(DE3) harboring pMH-GFP. Kinetic analysis of L-rhamnose dose-dependent GFP expression and growth of cells containing pAR-wtLacI (B) or pARmLacI (C). E. coli BL21(DE3) was used as control. The error bar denotes the standard deviation of the mean from the three replicates
표 Single-cell analysis of GFP expression by flow cytometry. Population of E. coli BL21(DE3) cells harboring pAR-mLacI and pMH-GFP (A) and those containing pARmLacI/pMW-GFP (B). Cells were induced with 0.7 mM IPTG and various concentrations of L-rhamnose. The inset graphs show average GFP fluorescence at various concentrations of Lrhamnose
표 GFP expression and growth of Lemo21(DE3) cells containing pMW-GFP at various concentrations of L-rhamnose with 0.7 mM IPTG. BL21(DE3) was used as control
표 Titrated expression of the CodB-GFP fusion protein from E. coli K-12 MG1655 harboring pAR-mLacI and pMH-CodB-GFP. L-Rhamnose dose-dependent kinetics of cell growth (A) and CodB-GFP production (B). Flow cytometry analysis of CodB-GFP production (C) and cell size (D). Fluorescence microscopy analysis of filamentous cells (E) or normal cells (F) expressing the CodB-GFP fusion protein with 4 mM L-rhamnose
표 LacI 변이체을 이용한 단백질 발현시스템
표 rFBA Model
표 PROM 모델을 이용한 조절 대사 통합 모델 구축
표 대장균 대사반응 네트워크의 degree 분포
표 두 연결성이 많은 이웃을 이어주는 다리위에 있어 큰 bridging centrality를 갖는 노드(n)의 예
표 Cascade set 과 cascade nummber의 예제: (왼쪽) Node 1의 cascade set={2,3,7,4}, cascade number=4 (오른쪽) Node 7의 cascade set={4}, cascade number=1
표 위 그림의 네트워크에서의 betweenness centrality와 bridging centrality
표 (A) Bridging centrality와 betweenness centrality 각각의 상위 5% 대산반응과 cascade set과 그것을 이끄는 대사반응의 교집합 개수 (B) Bridging centrality와 betweenness centrality 각각의 상위 10% 대산반응과 cascade set과 관련 대사반응의 교집합 개수
표 Bridging centrality 상위 2% 대산반응과 특징
표 Betweenness centrality 상위 2% 대사반응과 특징
표 Cascade subnetworks: (왼쪽) ASAD가 이끄는 casecade set의 경로 (오른쪽) GTPCI와 GTPCI2 가 이끄는 casecade set의 경로
표 (A) Bridging centrality의 분포에 따라 미생물 생장에 미치는 반응의 비율 (B) Betweenness centrality, bridging centrality의 분포에 따라 미생물 생장에 미치는 반응의 비율 (C) Clustering coefficient 분포에 따라 미생물 생장에 미치는 반응의 비율 (D) Degree 분포에 따라 미생물 생장에 미치는 반응의 비율
표 Cascade number에서 생장에 영향을 미치는 cascade set들의 개수
표 BL21(DE3)와 K-12 MG1655간 대사반응관련 유전자 비교
표 E. coli BL21(DE3) 대사네트워크 모델 구축 모식도
표 Phenotype microarray (PM) 실험결과. 빨간색은 BL21(DE3)의 생장곡선을, 녹색은 K-12의 생장곡선을 나타내며, 노한색은 두 균주에서의 공통생장면적을 나타냄. 각 PM plate 다음과 같은 96종의 다양한 기질 또는 생장환경을 제공함: carbon (PM1 and PM2), nitrogen (PM3), phosphorus and sulphur (PM4), auxotrophic supplement (PM5 to PM8), salt (PM9), pH stress (PM10), and inhibitory compounds such as antibiotics, antimetabolites, and other inhibitors (PM11 to PM20)
표 E. coli BL21(DE3)와 K-12의 탄소원 이용 비교
표 E. coli BL21(DE3)의 대사 네트워크들의 정확성 비교
표 E. coli BL21(DE3)와 K-12 의 central metabolic pathway상의 flux 비교

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