초록 ▼

1-1. 연구 목적: 암세포에서 유래된 microvesicle 내에 존재하는 miRNA가 암세포의 성장에 미치는 영향

1-2. 연구 방법: Ultracentrifugation을 통한 암세포 분비 microvesicle을 수집하고 microvesicle의 size 및 양을 측정하기 위해 nanoparticle tracking analysis, electron microscope 수행.
Microvesicle이 암세포 신혈관 생성 및 성장에 미치는 영향은 tube formation assay, proliferation

1-1. 연구 목적: 암세포에서 유래된 microvesicle 내에 존재하는 miRNA가 암세포의 성장에 미치는 영향

1-2. 연구 방법: Ultracentrifugation을 통한 암세포 분비 microvesicle을 수집하고 microvesicle의 size 및 양을 측정하기 위해 nanoparticle tracking analysis, electron microscope 수행.
Microvesicle이 암세포 신혈관 생성 및 성장에 미치는 영향은 tube formation assay, proliferation assay 수행. Microvesicle 내에 존재하는 miRNAs와 이들이 target하는 mRNA을 찾기 위해 miRNA array와 RNA sequencing을 수행한 후 promoter assay을 통해 검증. miRNA와 target mRNA의 임상적 의미는 비소세포폐암 환자 조직과 혈액을 통해 RT-PCR 및 immunohistochemistry을 수행하여 검증함.

1-3. 연구결과:
1) 특정 폐암 세포주에서 분비되는 microvesicle은 신 혈관생성을 촉진함: 비소세포폐암 세포주 (A549, H460) 그리고 정상세포 (BEAS-2B)에서 분비되는 microvesicle을 혈관세포에 처리 하였을 때 A549 세포주에서 분비되는 microvesicle 만이 혈관 생성을 촉진하는 것을 관찰함.
2) miRNA-619-5p는 RCAN1.4 mRNA을 target 함: A549, H460, BEAS-2B 세포에서 분비되는 microvesicle 내에 miRNA을 조사 한 결과 A549 분비 microvesicle 내에서만 11 종의 miRNAs이 증가 되어 있었으며 이러한 miRNAs과 RNA sequencing을 통해 감소된 RNA을 분석한 결과 TARGETscan 소프트웨어를 통해 miRNA-619-5p가 RCAN1.4의 3'-UTR에 두 개의 binding site가 존재함을 확인함. 이러한 결과는 promoter assay을 통해 재 검증.
3) 암세포에서 miRNA-619-5p에 의한 RCAN1.4 억제는 cellular mobility을 증가시킴: 비소세포 폐암에서 RCAN1.4 억제 시 invasion, migration이 증가되고 RCAN1.4 증가하였을 때 invasion, migration이 감소됨. 이러한 결과는 동물 전이 모델에서 재 검증.
4) 임상 검체에서 miRNA-619-5p와 RCAN1.4의 발현 검증: 비소세포 폐암 수술 환자 130명에서 암조직과 이웃하는 정상 폐 조직에서 miRNA-619-5p와 RCAN1.4의 발현을 확인한 결과 정상 세포에 비해 암조직에서 RCAN1.4 발현이 현저히 감소되어 있었으며 miRNA-619-5p는 증가되어 있었음. 통계적으로 miRNA-619-5p와 RCAN1.4의 발현은 음의 상관관계를 보임. 또한, RCAN1.4의 발현 저하는 환자 생존률에 나쁜 영향을 미침.
5) 폐암 환자 혈액에서 microvesicle내에 존재하는 miRNA-619-5p의 발현 검증: 정상 환자의 혈액과 폐암 환자의 혈액에서 microvesicle을 추출하고 miRNA-619-5p 발현을 분석한 결과 폐암 환자에서 현저하게 증가 되어 있었으며 miRNA-619-5p의 발현이 높은 환자의 암 조직에서 신혈관 생성이 크게 증가되어 있음을 확인.

1-4. 최종 결론: 특정 암세포에서 분비되는 exosome내에 존재하는 miRNA-619-5p는 RCAN1.4을 억제함으로써 주변 다른 암세포에 metastasis을 촉진하고 endothelial cell에 전달되었을 때는 신혈관 생성을 증가시킴으로서 암세포의 성장을 촉진시킴.

2-1. 연구 목적: PD-L1 positive microvesicle이 암세포의 면역 회피에 미치는 영향

2-2. 연구 방법: 비소세포 폐암 세포주에서 ultracentrifugation을 이용하여 microvesicle을 분리하고 특성 파악을 위해 nanoparticle tracking analysis, electron microscope 시행. PD-L1 발현여부는 immuno electron microscope, immuno fluorescence, western blotting 시행. 면역 세포의 활성 측정은 interleukin 2 (IL-2), interferon gamma (IFN-r) 의 생성을 ELISA로 분석. 비소세포 폐암 환자의 PD-L1 positive microvesicle 분리는 FACscan 시행.

2-3. 연구결과:
1) 비소세포 폐암세포주에서 PD-L1 발현과 분비되는 microvesicle 내에 존재하는 PD-L1 분석: 10 종 이상의 비소세포 폐암 세포주에서 PD-L1 발현을 분석한 결과 대부분의 세포주에서 PD-L1의 발현을 보였으며 세포 내에 발현이 높을 시 분비되는 microvesicle 내에 PD-L1 발현도 높게 나타남. Microvesicle 내에 PD-L1의 위치는 세포와 동일하게 plasma membrane에 위치함.
2) PD-L1 positive microvesicle은 면역세포의 IFN-r 생성을 억제함: PD-L1 발현 양상이 다른 microvesicle 얻기 위해 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 PD-L1 발현을 억제한 세포주와 정상적인 세포주에서 microvesicle을 수집한 후 Jurkat cell에 처리한 결과 PD-L1 positive microvesicle 만이 IFN-r의 생성을 억제하였고 또한, PD-L1 상호작용을 억제하기 위해 PD-L1 항체를 전 처리 한 군에서는 interferon gamma 생성 억제 효과가 현저하게 떨어짐.
3) 마우스 syngenic xenograft 모델에서 PD-L1 postive microvesicle은 암세포의 성장을 촉진함: 마우스 폐암 세포주인 LLC-1은 PD-L1 발현이 거의 없어서 과발현 시스템을 구축. in vitro 시스템에서 PD-L1 발현 여부에 따른 암세포의 성장은 차이를 보이지 않았지만 마우스에 xenograft을 만들었을 때 PD-L1 발현 LLC-1 세포주가 더 큰 tumor 성장을 보였으며 동일하게 PD-L1 positive microvesicle을 정맥으로 주입하였을 때도 더 큰 tumor 성장을 확인함. 아울러 PD-L1 발현 및 microvesicle을 처리한 tumor 조직에서는 proliferation indicator인 Ki-67 발현이 높았으며 tumor 조직으로 infiltration 된 CD3+ T 세포의 수가 감소되어 있음을 확인함.
4) 폐암 환자 혈액 및 조직에서 PD-L1 발현 확인: 폐암 환자 24명의 혈액과 조직을 이용하여 혈액에서는 microvesicle 바이오 마커인 CD9을 이용하여 microvesicle을 분리하고 동일 환자 조직은 PD-L1 immunohistochemistry을 수행하여 PD-L1 발현을 확인한 결과 조직 염색과 혈액내에 존재하는 PD-L1 positive microvesicle이 통계적으로 유의성 있게 일치함을 확인함. 또한 각 환자의 혈액에서 추출된 microvesicle과 동일 환자의 PBMC에서 분리된 CD8+ T 세포에 처리하였을 때 IL-2, IFN-r의 생성이 현저하게 감소됨을 확인함. 이러한 결과는 PD-L1 positive microvesicle의 비율이 높은 그룹에서 현저하게 나타남.
5) PD-L1 positive microvesicle은 T 세포의 세포 사멸을 유도함: 환자의 혈액 PBMC에서 분리된 CD8+ T 세포에 PD-L1 positive microvesicle을 처리 한 결과 CD8+ T 세포의 proliferation에는 영향을 미치지 않지만 세포의 사멸이 증가되는 결과를 보임.

2-4. 최종 결론: 암세포에서 분비되는 PD-L1 positive microvesicle은 host의 immune system을 억제 시킴으로써 암세포 성장 및 immune surveillance에 기여.

(출처 : 요약문 4P)

Abstract ▼

1-1. Purpose of study: Tumor-derived exosomal miRNA-619 promote tumor angiogenesis and metastasis through the inhibition of RCAN1.4

1-2. Methods: Cancer cell-derived exosomes were purified from NSCLC cells including A549, H460 and BEAS-2B. The characterization of each exosome was defined by u

1-1. Purpose of study: Tumor-derived exosomal miRNA-619 promote tumor angiogenesis and metastasis through the inhibition of RCAN1.4

1-2. Methods: Cancer cell-derived exosomes were purified from NSCLC cells including A549, H460 and BEAS-2B. The characterization of each exosome was defined by using NanoSight and electron microscopy. Expression levels of miRNAs within exosomes and the changes of mRNA were examined by miRNA array and RNA sequencing. The effects of exosomes and miRNAs on the aniogenic ability of endothelial cells were evaluated by tube formation assay. The ability of cellular mobility was determined by migration and invasion assay. The mRNA levels of miRNA-619-5p target gene RCAN1.4 in HUVECs were quantified by real-time PCR. Luciferase reporter assay was performed to examine the targeting relationship between miRNA-619-5p and RCAN1.4. Expression levels of miRNA-619-5p and RCAN1.4 in tissues with NSCLC patients were quantified by real-time PCR.

1-3. Results: we showed that the only of A549 cell-released exosomes promote an angiogenic phenotype in HUVEC cells compared to other lung cancer cell-released exosomes. Using a miRNA array approach, we identified that specific miRNAs can modulate agiogenesis in A549 cell-released exosomes. Among these miRNAs, miRNA-619-5p significantly induced angiogenesis in HUVEC cells. We found that miRNA-619-5p directly targeted RCAN1.4 and ectopic expression of miRNA-619-5p markedly decreased RCAN1.4 expression. In patients with non-small cell lung cancer (NSCLC), the level of RCAN1.4 expression was significantly lower in tumor tissue than normal lung tissues, whereas the level of miRNA-619-5p was a significant higher in tumor tissue than normal lung tissues. We also found that there was a significant inverse correlation between the expression of miRNA-619-5p and that of RCAN1.4. In addition, miRNA-619-5p expression was higher in exosomes isolated from plasma of patients with NSCLC than normal.

1-4. Conclusion: it might be possible for the level of miRNA-619-5p within exosome to be a utilized as a diagnosis and prognostic indicator for NSCLC patients. We are searching for the detailed mechanisms of angiogenesis and tumor growth through the inhibition of RCAN1.4.

2-1. Purpose of study: Exosomal PD-L1 promote tumor growth through immune escape in non-small cell lung cancer

2-2. Methods: Exosomes was isolated by ultracentrifugation. The characterization of purified exosomes was determined by nanoparticle tracking analysis and electron microscopy (EM). The presence of PD-L1 within exosomes was evaluated by western blotting, immunofluorescence, FACscan analysis and immuno-EM, and PD-L1 expression in tumor tissues from lung cancer patients was analyzed by immunohistochemistry. Cytokine production in T cells was performed by ELISA analysis.

2-3. Results: we show that exosomes derived from lung cancer cells express PD-L1 and play a role in immune escape by reducing T cell activity and promoting tumor growth. The abundance of PD-L1 on exosomes represented the quantity of PD-L1 expression on cell surfaces. Exosomes containing PD-L1 inhibited interferon-gamma (IFN-γ) secretion by Jurkat T cells. The IFN-γ secretion was restored by PD-L1 knockout or masking on the exosomes. Both the forced expression of PD-L1 on cells without PD-L1 and treatment with exosomes containing PD-L1 enhanced tumor growth in vivo. PD-L1 was present on exosomes isolated from the plasma of patients with non-small cell lung cancer, and its abundance in the exosomes correlated with the PD-L1 positivity on tumor tissues. Exosomes could impair immune functions by reducing cytokine production and inducing apoptosis in CD8⁺ T cells.

2-4. Conclusion: Our findings indicate that tumor-derived exosomes expressing PD-L1 may be an important mediator of tumor immune escape.

(출처 : Project Summary 6P)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 목차 ... 3
• 연구개발사업 최종연구개발결과보고서 요약문 ... 4
• Project Summary ... 6
• 1. 연구과제의 최종 연구개발 목표 ... 8
• 2. 연구과제의 연구대상 및 방법 ... 14
• 3. 연구과제의 연구개발결과 ... 19
• 4. 연구과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 39
• 5. 연구과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 41
• (1) 연구성과 총괄 ... 41
• (2) 연구성과 상세내역 ... 42
• (3) 연구개발과제의 목표달성도 ... 49
• 6. 연구과제의 활용계획 ... 49
• (1) 연구종료 3년까지 예상 연구성과 ... 50
• (2) 연구성과의 활용계획 ... 50
• 7. 참고문헌 ... 50
• 8. 첨부서류 ... 52
• 끝페이지 ... 53