초록 ▼

연구의 목적 및 내용
< 연구의 목적 >
- 연수막암종증은 고형암의 뇌척수액 전이로 인한 중추신경계 기능마비로 진단 후 2-3개월 내 사망에 이르는 terminal cancer disease이나 지난 30년 동안 뇌척수액 항암제 주입치료 외에 새로운 치료가 시도되지 못하고 있다.
- 뇌척수액 항암치료는 신경독성에 대한 우려 때문에 수용성 methotrexate외에 다양한 cytotoxic chemotherapy를 투입하지 못하고 있음. 또한 target inhibitor의 경우도 고형암세포가 뇌척수액이라는 aqeou

연구의 목적 및 내용
< 연구의 목적 >
- 연수막암종증은 고형암의 뇌척수액 전이로 인한 중추신경계 기능마비로 진단 후 2-3개월 내 사망에 이르는 terminal cancer disease이나 지난 30년 동안 뇌척수액 항암제 주입치료 외에 새로운 치료가 시도되지 못하고 있다.
- 뇌척수액 항암치료는 신경독성에 대한 우려 때문에 수용성 methotrexate외에 다양한 cytotoxic chemotherapy를 투입하지 못하고 있음. 또한 target inhibitor의 경우도 고형암세포가 뇌척수액이라는 aqeous phase에 적응하며 active spread를 하는 병리기전에 대하여 아직 알려진 바가 없어 개발되지 않고 있다.
- 원발암의 유전체 정보를 profiling하여 뇌척수액 전이 경향을 파악하려는 시도는 있었으나 이는 뇌척수액 전이 환경에서의 암세포의 evolution을 반영하지 못하는 치명적 단점이 있다. 본 연구는 뇌척수액 유전체 연구를 통해 liquid biopsy의 장점인 cancer evolution을 반영하는 유전체 profiling 및 driver mutation을 찾는 시도이며 precision medicine의 구현이라 할 수 있다.
- 뇌척수액은 1회 샘플의 양이 제한적이어서 (5-10mL) microarray data를 이용한 profiling이 연수막암종증에서 이루어진 바가 없다. 연구자들은 2 mL의 CSF sample에서 RNA microarray를 시행할 수 있는 platform을 개발하였다.
- 연구자들은 다양한 뇌척수액 내 유전체 origin을 고려하여 연수막암종증 뿐 아니라 뇌종양 및 뇌전이종양, 전신암 및 중추신경계 염증성 질환을 포함하는 6개 환자군별 100여개 씩의 샘플을 이전의 바이오마커 연구룰 통하여 확보하였음.
- 연구자들은 예비연구를 통하여 확립한 CSF analysis platform을 이용하여 뇌척수액내 미량의 유전체를 추출하고 1) microRNA 및 cell-free DNA microarray, 2) primary vs. CSF floating cancer cell DNA matched analysis 결과를 수집-분석하여 연수막 암종증 발생경로 파악 및 druggable target을 발견하고자 하였다.
- In vitro cell line functional study와 연수막전이 마우스 모델을 이용하여 발견된 target을 전임상 수준에서 검증하고자 하였음

< 연구의 내용 >
-뇌척수액 전이암 환자군 및 대조군을 포함한 75례의 뇌척수액 extracellular RNA를 추출하여 small RNA microarray를 시행하였고 Prediction Anaysis of Microarray 및 연수막 암전이 vs. 뇌실질 암전이의 Significance Anaysis of Microarray를 실시하여 연수막 암전이를 특정하는 microRNAs를 발굴하고 Gene Ontology pathway를 수행하였다
- 연수막 암전이 환자군의 뇌척수액 항암치료 전후 세포외 소체 (Extracellular vesicles)의 농도 변화를 관찰하고 치료 후 Ev 증가 환자군의 생존기간이 유의하게 향상되었으며 이들중 비소세포성 폐암 환자군의 경우 onco-miR인 miR-21의 발현이 유의하게 감소함을 관찰하였다.
- 연수막 암전이 환자군 (10례)와 정상 대조군 (2례)의 small RNA seq을 수행하여 다양한 종류의 RNA 분포를 확인하였고 over-expressed/ suppressed miR의 anotation을 수행하였다.
- 연수막 암전이 환자군 10명에서 exosomal vs non-exosomal RNA를 분리 추출하여 microarray를 실시하였다. 비교 분석 실시 중
- 연수막 암전이 환자군에서 cell-free DNA의 존재를 확인하고 whole exome seq을 수행할 수 있는 quality & quantity임을 확인하였다.

연구개발성과
< 정량적 성과1) >
1) 총연구기간 내 목표 연구성과로 기 제출한 값
< 정성적 성과 >
1. 뇌척수액 전이암 환자군 및 대조군을 포함한 75례의 뇌척수액 extracellular RNA를 추출하여 small RNA microarray를 시행한 결과를 분석하여 그 raw data를 NCBI Gene Expression Omnibus에 등재하였고 (GSE 138029), 그 분석 결과는 Nucleic Acid Research (IF=11.1)에 투고하였다.

2. 연수막 암전이 환자군에서 뇌척수액 항암 치료 전후의 세포외 소체 농도변화와 microRNA-21의 발현 증감이 치료 반응 및 환자예후를 예측할 수 있음을 발견하여 Jouranl of Extracellular Vesicles (IF=11,0)에 투고하였고 2019-11-23 국제학회 (Society of Neuro-oncology)에서 구연 발표예정이다.

연구개발성과의 활용계획(기대효과)
- Exosome과 microRNA의 정량화로 확립된 바이오마커는 일반적인 암치료의 반응 판정기이 적용되지 않는 연수막 암종증에서 새로운 기준으로 자리매김 할 것이 확실하며 이는 이차적으로 그동안 부진하였던 연수막 암종증 연구의 부흥을 유도하고 역시 기술로 특허화 가능함.
- 그 기전이 잘 알려지지 않은 연수막 암종증의 발생 원인을 밝힐 수 있는 유전체적 특성을 밝혀 향후 target therapy의 기초를 닦음.
- Druggable target이 성공적일 경우, 지난 30년간 치료의 발전이 없으며 뇌척수액으로 주입될 수 있는 약물의 생화학적 제한성 (limitation) 때문에 새로운 항암제의 개발이 어려운 연수막 암종증에서, 새로운 약물이나 표적 치료 방법을 개발할 수 있는 초석이 되며 세계적인 치료의 선도 역활을 하게 됨.

(출처 : 요약문 2p)

Abstract ▼

Purpose&Contents
< Purpose >
- Leptomeningeal carcinomatosis (LMC) is a terminal cancer disease with dismal prognosis. Intra-cerebrospinal fluid (CSF) chemotherapy could only show marginal survival benefit. Due to limitation of introducing new drug, the treatment for LMC have not advanced duri

Purpose&Contents
< Purpose >
- Leptomeningeal carcinomatosis (LMC) is a terminal cancer disease with dismal prognosis. Intra-cerebrospinal fluid (CSF) chemotherapy could only show marginal survival benefit. Due to limitation of introducing new drug, the treatment for LMC have not advanced during the past decades.
- Pathogeneis of LMC is largely unknown. Researchers have anlayzed the genomic profiling of primary cancer for predicting LMC. But there are obvious limitations from not reflecting the characteristics of floating cancer cells.
- We would like to perform CSF genomics profiling in the context of ‘liquid biopsy’, which could reflect cancer evolution and disease progression on repeated examination. The evaluated expression pattern will lead us to druggable target for precision medicine.
- We collected about 2,500 CSF samples including CNS tumorous condition and inflammatrory disease, and established CSF analsys platform yielding metabolomics via mass spectrometry, both qualitative and quantitative analysis of nano-sized particles of nuecleic acid and exosome, microarray of microRNA and cell-free DNA, and matched analsysis of primary cancer and leptomeningeal carcinomatosis.
- CSF genomics data will reveal certain molecular pathway and driver mutation responsible for LMC, suggesting a druggable target.

< Contents >
[1] CSF samples reflecting various source of genomic materials
-The origin of CSF genomic materials are systemic circulation, brain, immune reaction and floating cancer cell. We need following groups; Systemic cancer without CNS disease, Healthy control, Leptomeningeal carcinomatosis, Brain metastasis, Brain tumor and Other CNS disease without cancer
[2] Extraction of DNA/RNA using CSF analysis platform
- We developed CSF analysis platform to extract DNA/RNA for microarray (150-300ng의 RNA/DNA). For this purpose, we use CSF sample 2 mL.
- To overcome a lack of cellular housekeeping gene in CSF, we measured exosome in quantity for standardized Ct value in qRT-PCR.
[3] Developing Responsible molecular pathway for LMC
- Thourough microRNA microarray and RNA seq of CSF we profile the expression pattern of each patients group. By comparative analysis, over-/under-expression of microRNA/RNA will implicate responsible molecular pathway for LMC.
- We separately extract exosomal vs. non-exosomal RNA for qRT-PCR to evaluate the origin of microRNA (cancer cell vs. systemic circulation).
[4] Developing acquired DNA mutation for LMC
- By comparison of cell-free DNA microarray profile, we could expect to have a different mutation pattern among patients groups. For example, unique DNA mutation in brain metastasis from systemic cancer, could be an early marker for brain metastasis.
-In vitro study; We will adopt shRNA　technique to knock down developed responsible molecular pathway and perform functional study such as migration, invasion and cell anchoring in established cell lines.

Results
- We performed small RNA microarray of 75 CSF samples including leptomeningeal metasis with various control groups. Prediction Anaysis of Microarray (PAM) and Significance Anaysis of Microarray between leptomeningeal metastasis and parenchymal brain metastasis annotated discriminative microRNAs of leptomeningeal metastasis. Ten out of 13 microRNAs from PAM was common to SAM differentiate microRNAs for leptomeningeal metastasis. Gene Ontology pathway analysis was also performed using both PAM and SAM picked-up microRNAs and 78% of denoted pathways are common to each other (Submitted to Nucleic Acid Research, IF = 11.1)
- We observed the extracellular vesicle (Ev) concentration change after intraventricular chemotherapy in patients with leptomeningeal metastasis.
Patients with decreased Ev concentration showed significantly prolonged overall survival. Subgroup analysis of patients with leptomeningeal metastasis from non-small celll lung cancer revealed miR-21, a well-known oncomir in these patients were suppressed in favorable group of increased Ev concentraion whereas it increased tens of times after the treatment in unfavorable group of decreased Ev concentration. We suggested the combination of Ev concentration andn miR-21 as a biomarker for leptomeningeal metastasis treatment. (submitted to Journal of Extracellular Vesicles, IF = 11.0)
- We performed NGS (small RNA seq) of 10 individual CSF samples from the patients with leptomeningeal metastasis with two healthy controls. The distribution of various RNAs including Y-RNA, pi-RNA, snoRNA etc., We annotated the significantly over-expressed or suppressed microRNAs and their expression levels were confirmed with digital droplet RT-PCR (under preparation of manuscript for publication).
- With 10 CSF samples of leptomeningeal metastasis, we separately collected exosomal and non-exosomal RNA and underwent small RNA microarray. We’re ongoing analysis.
- We succssefully extracted cell-free DNA from CSF of leptomeningela metastasis, which mmet the QC criteria for whole exome sequencing. The cell-free DNA was absent in control groups.

Expected Contribution
Analysis of CSF genomic material along with nano-sized particles including exosome and metabolome will give us a finger-print diagnosis of various CNS disease.
- Qunatitative measurement of exosome and microRNA can be used as a surrogate biomarker of LMC, for which treatment response measuring such as CSF cytology or neuroimaging is not applicable.
- Profiling of CSF DNA/microRNA will reveal a druggable target. And we could use it to develop targted therapy for LMC.

(출처 : SUMMARY 4p)

목차 Contents

• 표지 ... 1국문 요약문 ... 2SUMMARY ... 4목차 ... 61. 연구개발과제의 개요 ... 72. 연구수행 내용 및 결과 ... 11 [1] 연수막 암전이 환자군 및 대조군에서 extracellular RNA추출하여 microarray profiling ... 11 [2] 뇌척수액 microRNA expression level의 digital droplet PCR을 이용한 정량화 측정 및 세포외 소체 농도를 이용한 normalization ... 12 [3] 뇌척수액 exosomal vs. non-exosomal RNA의 분리추출 후 microarray 및 NGS 수행 ... 14 [4] 연수막 암전이 환자에서 원발암 vs. 전이암 vs. 뇌척수액 전이 암세포의 유전체 비교 분석 ... 153. 연구결과의 중요성 및 활용 방안 ... 16 [1] CSF analysis platform의 확립 및 CSF extracellular RNA expression level의 세포외 소체 농도를 이용한 표준화 (normalization) ... 16 [2] CSF genomics study의 멀티오믹스 분석에 의한 병태생리 기전 연구 및 표적치료제 발굴 ... 164. 연구수행 달성도 ... 175. 연구개발과제의 대표적 연구실적 ... 176. 참여연구원 현황 ... 197. 기타사항 ... 198. 참고문헌 ... 19II. 제1세부과제 ... 20 제1세부 최종 보고서 ... 21 국문 요약문 ... 22 SUMMARY ... 24 목차 ... 26 1. 연구개발과제의 개요 ... 27 2. 연구수행 내용 및 결과 ... 31 3. 연구결과의 중요성 및 활용 방안 ... 35 4. 연구수행 달성도 ... 36 5. 연구개발과제의 대표적 연구실적 ... 36 6. 참여연구원 현황 ... 37 7. 기타사항 ... 38 8. 참고문헌 ... 38끝페이지 ... 38