초록 ▼

식중독 확산 조기 차단을 위해 식중독 원인균의 신속한 규명이 매우 중요하다. 따라서 본 연구에서는 현행 식중독 세균 신속검사법 최적화를 통해 식중독균 검출능력 향상 및 신뢰성을 확보하고자 하였다.

17종 식중독 세균(병원성 대장균 5종, 쉬겔라, 살모넬라, 여시니아 엔테로콜리티카, 바실루스세레우스, 황색포도상구균, 비브리오 3종, 캠필로박터 2종, 리스테리아 모노사이토제네스, 클로스트리디움 퍼프린젠스)에 대해 증균방법 평가, 유전자검사법 비교와 식중독 신속검사차량에 적용할 수 있는 전처리법, 유전자 추출법, 유전자검사법

식중독 확산 조기 차단을 위해 식중독 원인균의 신속한 규명이 매우 중요하다. 따라서 본 연구에서는 현행 식중독 세균 신속검사법 최적화를 통해 식중독균 검출능력 향상 및 신뢰성을 확보하고자 하였다.

17종 식중독 세균(병원성 대장균 5종, 쉬겔라, 살모넬라, 여시니아 엔테로콜리티카, 바실루스세레우스, 황색포도상구균, 비브리오 3종, 캠필로박터 2종, 리스테리아 모노사이토제네스, 클로스트리디움 퍼프린젠스)에 대해 증균방법 평가, 유전자검사법 비교와 식중독 신속검사차량에 적용할 수 있는 전처리법, 유전자 추출법, 유전자검사법을 비교·평가하였다.

병원성 대장균, 살모넬라, 쉬겔라, 여시니아 엔테로콜리티카, 바실루스 세레우스, 황색포도상 구균은 식약처(TSB, 35℃)와 질병관리본부 시험법(TSB, 37℃)에 차이가 없어 TSB 36±1℃로 통일화가 가능할 것으로 판단되었다. 비브리오의 경우 현행 원인조사 시험법은 TSB, 35℃로 제시되어 있으나, 질병관리본부 시험법인 APW에서 비브리오 3종 모두 증균 속도가 더 빨랐다. 특히 비브리오 패혈증균의 경우 APW에서만 생장하는 것이 확인되어, 원인조사 시험법의 배지를 APW로 변경하는 것이 좋을 것으로 판단되었다.

위 검토된 시험법을 식품에 적용하였을 때, 4~6시간 내 2 log 이상 균 증가를 확인하였으며, 이는 식품에 1 CFU/g의 균이 오염되었을 때 신속검사법으로 검출할 수 있을 것으로 판단된다. 질병관리본부와의 시험법 조화 요구에 따라 cPCR 특이도를 검증한 결과, 일부 유전자에서 차이가 있었다. 장흡작성대장균(aggR)의 경우 원인조사 시험법의 특이도가 더 뛰어난 반면, 장독소원성대장균(STp)은 비특이적 결합이 없는 수인성 시험법으로 변경하는 것이 좋을 것으로 판단되었다. 바실루스 세레우스는 기존 분석 유전자(hblD, bceT) 외에 nheA 유전자의 추가가 가능할 것으로 판단되었다. 황색포도상구균의 16s rRNA 시험법은 개별 PCR 조건으로 검사 시 비특이적인 결합이 많이 나타나 상대적으로 비특이적 결합이 적게 나타난 multiplex PCR의 조건으로 변경이 필요하다. 또한, 황색포도상규군은 다양한 독소 유전자를 검출하기 위하여 수인성 시험법의 seg, seh, sei 유전자를 추가할 수 있는 것으로 판단되었다. 리스테리아 모노사이토제네스의 경우 현행 원인조사 시험법의 primer 농도 조정이 필요한 것으로 나타났다. 클로스트리디움 퍼프린젠스(cpa, cpe )에 대해서는 원인조사 시험법의 검출율이 높은 것으로 확인되었다.

검체량, 검체 희석액, 농축단계 추가 등 전처리 조건을 비교, 검토하여 식중독균 신속검사 시험법을 변경하였다. 식품 적용 시, 대상 균주(17종)와 식품 종류에 관계없이 10² CFU/g 까지 모두 검출이 가능함을 확인하였으며, 일부 유전자는 10¹ CFU/g 까지도 검출이 가능하였다. 이는 기존 방법의 검출한계와 비교하여 10¹~10³ CFU/g 감소시켜 민감도를 향상시켰다.

보다 효율적인 유전자 추출을 위해 배양액과 식품에서 식중독 신속검사차량에서 사용 가능한 3가지 유전자 추출법을 검토하였다. 또한, 현 이동차량 시험법에서 사용하는 시험법과 동일 형태(20 plex)로 제작된 real-time PCR kit를 검토하였다. 그 결과, 추출법과 real-time PCR kit 모두 현행 시험법의 검출한계가 우수한 것으로 나타났다.

본 연구를 통해 민감도와 효율성이 향상된 시험법을 식중독 원인조사에 적용함으로써 식중독균 신속 검출에 기여할 것으로 기대된다.

(출처 : 요약문 2p)

Abstract ▼

Rapid identification of food-borne pathogens is important to prevent the spread of food poisoning. The purpose of this study is to improve the detection ability and reliability of food poisoning bacteria through the optimization of current food poisoning bacteria rapid detection method.

This

Rapid identification of food-borne pathogens is important to prevent the spread of food poisoning. The purpose of this study is to improve the detection ability and reliability of food poisoning bacteria through the optimization of current food poisoning bacteria rapid detection method.

This study evaluated the enrichment and PCR (real-time PCR) method for detection of food-borne pathogens, and pre-treatment of foods, extraction of nucleic acid and real-time PCR with about seventeen food-borne pathogens (Pathogenic E. coli, Shigella spp., Salmonella spp., Y. enterocolitica, B. cereus, S. aureus, Vibrio spp, Campy. jejuni/coli, L. monocytogenes and Clo. perfringens).

There were no significant differences between a growth rate of MFDS (TSB, 35℃) and KCDC methods (TSB, 37℃) about pathogenic E. coli, Shigella spp., Salmonella spp., Y. enterocolitica, B. cereus, S. aureus. Thus, it is expected that the condition in TSB at 36±1℃ be provided with harmonized method. Vibrio spp. in APW were increased faster than using TSB. V. vulnificus only increased in APW.

For requirement to unify of the test methods, the PCR assay methods of the MFDS and KCDC were reviewed. We evaluated the gene specificity of each standard and domestic separatory strains, the result was shown to differ at some genes. In particular, for the aggR gene in EAEC, the specificity of the MFDS method is better, whereas the STp gene in ETEC has shown many non-specific combinations in its analysis. Therefore, it was determined that the STp gene verification test in ETEC should be changed to the KCDC method. In addition, gene of B. cereus (nheA) and S. aureus (seg, seh, sei) could be added in MFDS method for detection of variety toxin genes.

The aim of this study was improving sample processing for rapid and accurate detection of food-borne pathogens in the mobile laboratories of MFDS. The bacteria culture was inoculated into each 5 g of various foods, respectively, with final contamination level of 1~4 log CFU/g. To increase the detection sensitivity and convenience of sample treatments, sample processes were compared with previous method such as sample volume, dilution ratio, and concentration. As the result, the lowest detection (2 log CFU/g) was shown on improved method – sample volume (25 g to 5 g), dilution ratio (1:10 to 1:1), concentration with centrifuge (10,000 rpm, 1 minute) - while the detection limit was 3 log CFU/g by the previous method in various foods about tested 17 strains.

More efficient gene extraction is required to perform experiments in confined spaces, such as food poisoning mobile vehicle laboratories. We evaluated three DNA extraction equipment, including used in food poisoning mobile vehicles, for their ability to extract DNA from bacterial cultures and artificially inoculated read-to-eat foods through real-time PCR. Based on the result of this research, we expect more sensitive detection of food-borne pathogens by improving sample processing prior to real-time PCR process in the mobile labs of MFDS.

(출처 : Summary 4p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 국문 요약문 ... 2
• Summary ... 4
• 목차 ... 6
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 7
• 제1절 연구개발과제의 목표 ... 7
• 제2절 연구개발과제의 필요성 ... 8
• 제2장 연구개발과제의 국내·외 연구개발 현황 ... 12
• 제1절 국내 연구개발 현황 ... 12
• 제2절 국외 연구개발 현황 ... 15
• 제3절 국내외 식중독균의 주요 분석기술 ... 21
• 제3장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과 ... 27
• 제1절 재료 및 방법 ... 27
• 제2절 연구결과 ... 68
• 제4장 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 323
• 제5장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 326
• 제6장 연구개발과제의 연구개발 결과 활용계획 ... 327
• 제1절 연구성과 및 활용계획 ... 327
• 제7장 참고문헌 ... 329
• 제8장 첨부서류 ... 335
• 끝페이지 ... 336