초록 ▼

○ 식물에서 CRISPR-MAD7의 유전자 교정 확인을 위하여 human과 애기장대를 대상으로 한 codon optimized transcript를 확보하여 형질전환 벡터를 개발함
○ 또한 DNA-free MAD7 유전자 교정 시스템 개발을 위하여 MAD7 단백질을 E. coli를 이용하여 재조합단백질을 정제 하여 MAD7 단백질과 guide RNA를 식물의 원형질체에 PEG를 이용하여 도입하는 방법을 수행함
○ 애기장대 원형질체에서 유전자 교정 효율을 검증 한 결과 대조구로 사용된 Cas9이 발현된 형질전환벡터는 1.5

○ 식물에서 CRISPR-MAD7의 유전자 교정 확인을 위하여 human과 애기장대를 대상으로 한 codon optimized transcript를 확보하여 형질전환 벡터를 개발함
○ 또한 DNA-free MAD7 유전자 교정 시스템 개발을 위하여 MAD7 단백질을 E. coli를 이용하여 재조합단백질을 정제 하여 MAD7 단백질과 guide RNA를 식물의 원형질체에 PEG를 이용하여 도입하는 방법을 수행함
○ 애기장대 원형질체에서 유전자 교정 효율을 검증 한 결과 대조구로 사용된 Cas9이 발현된 형질전환벡터는 1.5~4.7%의 indel 효율을 AtPDS3 유전자에서 보였지만 MAD7의 경우 indel효율이 0-0.03%로 확인됨
○ 애기장대에서 MAD7-RNP 복합체를 이용한 유전자 교정을 수행한 결과 0.1 ~ 0.3%의 In-del 효율을 보이는 것으로 확인 하였으며, 이는 Cas9을 사용한 RNP 방범에서 확인된 약 1.75%의 교정효율과 비교했을 대 매우 효율이 낮은 것으로 확인됨
○ MAD7에 의한 교정 효율을 높이기 위해서 단백질 활성을 높일 수 있는 고온(29℃) 조건과 단백질 구조 안정화에 도움을 준다는 gRNA 3말단에 poly-U tail 추가 하여 연구를 수행 하여 대조구 대비 교정효율은 높였으나 endonuclase 대조구인 Cas9에 비하여 효율이 낮은 것을 확인함
○ 형질전환 벡터를 이용하여 유전자가위가 전달된 형질전환 식물체는 확보하였으나 MAD7을 이용한 형진전환 식물체에서 타겟유전자의 유전자교정이 완성된 식물체를 확보하지 못함
○ 애기장대 이외의 작물에서 MAD7의 유전자교정여부를 확인하기 위하여 RNP 방법을 사용하여 양배추의 MYBL2, 토마토의 PDS, 배추의 PDS 유전자를 타겟으로 유전자교정실험을 수행함. 토마토의 PDS의 경우 0.1%의 indel 효율이 관찰되었으나 양배추, 배추의 경우 MAD7에 의한 indel이 관찰되지 않았음
○ 실험결과 MAD7은 로열티 free라는 이점이 있지만 작물에서 유전자교정 효율이 낮은 단점이 있음. 추후 MAD7 단백질에 대한 최적화 연구를 통하여 MAD7의 유전자교정효율을 높이는 연구가 필요함

(출처 : 요약서 3p)

Abstract ▼

IV. Results
○ A vector for the expression of CRISPR/MAD7 system was developed using human (hMAD7) and Arabidopsis (AtMAD7) codon-optimized versions of MAD7 and expressed in Arabidopsis protoplast. Four different expressed gRNAs targeting PDS3 with hMAD7 created 0 % indels, while the AtMAD7 editin

IV. Results
○ A vector for the expression of CRISPR/MAD7 system was developed using human (hMAD7) and Arabidopsis (AtMAD7) codon-optimized versions of MAD7 and expressed in Arabidopsis protoplast. Four different expressed gRNAs targeting PDS3 with hMAD7 created 0 % indels, while the AtMAD7 editing efficiency with gene specific control gRNAs was 0-0.03 %. Therefore, expression of AtMAD7 might be more stable than hMAD7 in the plant system. The CAS9 editing efficiency was 1.5-4.7 %.
○ Earlier report suggested that MAD7 protein was more efficient at higher temperatures. The MAD7 protein was 0.03% efficient at 22℃, but 0.4% efficient at 29℃. The gene editing efficiency of CAS9 was higher than MAD7 at 22℃.
○ To generate transgenic Arabidopsis lines (T1), the vector containing the CAS9 or MAD7 genes and the single guide RNA (sgRNA) were delivered via Agrobacterium-mediated transformation. The transgenic plants containing CAS9 gene showed albino phenotype, but the MAD7 expressing transgenic plants showed normal phenotype. The transgenic plants were subjected to 290C,butdidnotshowalbinophenotype.
○ DNA-free genome editing in plants using CRISPR-MAD7 ribonucleoproteins (RNP) was developed. MAD7 protein was expressed in E. coli and purified. MAD7 and sgRNA were transformed using a PEG based method.
○ CAS9/sgRNA-RNP created 1.75 % indels, while the MAD7/sgRNA-RNP editing efficiency with gene specific control gRNAs was 0.1-0.3 % when using Arabidopsis protoplast.
○ The gene editing efficiency of MAD7/sgRNA-RNA was 0.47% higher at 32℃ compared to 22℃ and 29℃, suggesting that temperature might play an important role in MAD7 activity.
○ Earlier report has suggested that uridine induced structural stability and increased the editing efficiency. However, addition of 4 or 6 uridines does not appear to change genome editing efficiency in Arabidopsis protoplasts
○ MAD7/sgRNA-RNP editing efficiency were tested in Arabidopsis, Brassica, tomato and lettuce protoplasts. PDS genes was targeted in tomato and lettuce and MYBL2 gene was targeted in Brassica. Only 0.1% of indel was created in tomato, and there was no mutation in Brassica or lettuce.
○ MAD7 is freely available, but efficiency of genome editing in plants is very low. It is therefore necessary to find alternate ways to increase the genome editing efficiency.

(출처 : SUMMARY 8p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 2
• 보고서 요약서 ... 3
• 요 약 문 ... 4
• SUMMARY ... 7
• CONTENTS ... 10
• 목차 ... 11
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 12
• 제 1 절 연구개발의 필요성 ... 12
• 제 2 절 연구개발대상 기술의 경제적·산업적 중요성 ... 15
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 18
• 제 1 절 국내외 연구현황 ... 18
• 제 2 절 연구과제의 창의성 및 혁신성 ... 19
• 제 3 절 연구개발의 목표 및 내용 ... 19
• 제 4 절 추진전략 및 추진체계 ... 20
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 22
• 제 1 절 MAD7 발현 벡터 개발 ... 22
• 제 2 절 애기장대 원형질체에서 MAD7 유전자 교정 검증 ... 28
• 제 3 절 형질전환 벡터를 이용한 유전자 교정 식물체 개발 ... 34
• 제 4 절 DNA-free MAD7 유전자 교정 시스템 개발 ... 37
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 47
• 제 1 절 정성적 연구목표 ... 47
• 제 2 절 정량적 연구목표 ... 47
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 및 기대효과 ... 49
• 제 1 절 연구개발결과의 활용계획 ... 49
• 제 2 절 연구개발결과의 활용계획 ... 49
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 50
• 제 7 장 연구시설‧장비 현황 ... 51
• 제 8 장 참고문헌 ... 52
• 끝페이지 ... 53