표 Restriction-modification 시스템의 분류 (Sistla 2004) 표 Bacillus 균의 R-M 시스템 요약 (REBASE) 표 B. subtilis의 R-M 시스템 확인 표 효모의 in vivo assembly 모식도 표 DNA MTase의 one step cloning을 위한 벡터 map 표 B. subtilis 168과 KCTC1028에서 형질전환 효율 검정 표 B. subtilis의 형질전환 기작. (A) natural competence 모식도 (http://2014.igem.org/Team:Calgary/Project/BsDetector/BsChassis). competence와 관련된 Com regulon을 이용하여 세포 밖에 존재하는 DNA를 세포 내로 도입시킴. (B) electroporation 모식도 (Du, et al. 2018). 순간적인 전기 충격을 통해 세포막의 투과성을 변화시켜 외부 DNA를 도입시킴 표 (A) EBC donor cell 모식도. 염색체 내로 삽입시킨 플라스미드 RP4의 conjugative machinery 도움을 받아 원하는 플라스미드를 recipient cell로 도입시킴. (B) BBC donor cell 모식도. 플라스미드 pLS20의 conjugative machinery 도움을 받아 원하는 플라스미드를 recipient cell로 도입시킴 표 야생형 B. subtilis 균주에서 여러 형질전환 방법에 따른 효율 비교. x축에서 168은 B. subtilis 168을, 나머지 숫자는 KCTC에서 분양받은 균주 번호를 의미함 표 MICE 시스템 모식도. (A) ICE와 MICE의 유전적 인자 비교. (B) ICE와 MICE의 DNA 전달 기작 표 (A) MICE 형질전환 효율 확인 및 (B, C) 야생형 B. subtilis 균주들의 GFP 활성 비교 표 야생형 B. subtilis 균주에서 GFP 발현 확인 표 QPS Bacillus 균주들에서 GFP 활성 확인 표 CRISPR-Cas9을 사용한 multiple gene editing 과정 표 Self-targeting gRNA에 의한 plasmid self-curing 효율 확인 (A) Self-curing 검증을 위해 제작된 플라스미드. sgRNAst과 sgRNAct는 각각 self-targeting, chromosome-targeting을 위한 sgRNA를 의미함. (B) 플라스미드 curing 효율 확인 표 B. subtilis에서 연속적인 genome editing 모식도 표 Programmed gRNA removal system을 이용한 B. subtilis에 있는 8개의 세포 외 단백질 분해 효소 (extracellular protease)의 순차적인 유전자 결실 (A) Mutation 및 plasmid curing 효율 확인 (B) FTC-casein을 이용한 protease assay 결과 표 특정 위치의 시토신(C)을 티민(T)으로 전환시키는 cytosine base editing의 모식도 표 B. subtilis을 위한 cytosine base editor (CBE) 시스템 개발 (A) 최적화된 CBE 선별을 위한 제작된 네 종류의 플라스미드 (B) CBE 효율 검증을 위한 GFP 형광 유전자 표적 gRNA 설계 (C) 각 CBE 플라스미드의 효율 확인 표 CBE4의 editing window 확인 (A) 편집 범위 확인을 위해 선정된 6개의 gRNA의 위치 및 서열 (B) 각 시토신 위치에서의 평균 돌연변이 효율 표 CBE4 매개 multiplex genome editing의 효율 및 off-target 영향 (A) 다중 동시 표적에 따른 돌연변이 효율 확인 (B) Protease 표적 균주에 대한 protease assay 결과 (C) CBE4에 의해 제작된 돌연변이 균주 genome 내의 nucleotide 변화 확인 (D) 돌연변이 균주별 off-target에 따른 유의미한 아미노산 변화의 수 표 cry3Aa 프로모터 변이체, CRE 공통염기서열, gfp 유전자를 포함한 플라스미드 도식 표 CRE 염기 서열을 포함하는 cry3Aa 프로모터 변이체들을 도입시킨 Bacillus 균주의 GFP 발현양 비교. (A) pDC5D: CRE 염기서열을 포함하지 않는 cry3Aa 프로모터, (B) pDC5DCF: –35 앞에 CRE 염기 서열이 위치한 cry3Aa 프로모터, (C) pDC5DCM: –35과 -10 사이에 CRE 염기 서열이 위치한 cry3Aa 프로모터, (D) pDC5DCB1: –10 뒤에 1개의 CRE 염기서열이 위치한 cry3Aa 프로모터, (E) FB1; pDC5DCF-4와 pDC5DCB1-1의 CRE 염기 서열을 합친 cry3Aa 프로모터, MB1; pDC5DCM-3과 pDC5DCB1-1의 CRE 염기 서열을 합친 cry3Aa 프로모터를 의미함. LBG2; 2% 포도당이 첨가된 LB 배지를 의미함. (F) 단백질 전기영동으로 각 형질전환체들의 GFP 발현량을 확인하였음. -; 포도당 무첨가, +; 포도당 첨가를 의미함 표 CRE 염기 서열을 포함하는 cry3Aa 프로모터 변이체들을 도입시킨 Bacillus 균주의 GFP 발현양 비교. (A) pDC5DCB1; –10 부위 뒤에 1개의 CRE 공통염기서열을 포함한 cry3Aa 프로모터, (B) pDC5DCB2; –10 부위 뒤에 2개의 CRE 공통염기서열을 포함한 cry3Aa 프로모터, (C) pDC5DCB4; –10 부위 뒤에 4개의 CRE 공통염기서열을 포함한 cry3Aa 프로모터 LBG2는 포도당이 2% 첨가된 LB 배지를 의미함 표 (A) pDC5DB1, (B) pDC5DB2, (C) pDC5DB4 라이브러리 중 상위 10개 균주들의 GFP 활성 비교. (D) 선정된 프로모터 변이체의 포도당에 의한 발현 억제 비율 표 단백질 전기영동으로 pDC5DCB4 라이브러리 중 상위 10개 균주의 GFP 발현량 확인. LBG2는 포도당이 2% 첨가된 배지를 의미함 표 P450의 발현 여부를 단백질 전기영동으로 확인. P5D; CRE 염기서열을 포함하지 않는 cry3Aa 프로모터, P5DCB4; –10 부위 뒤에 4개의 CRE 공통염기서열을 포함한 cry3Aa 프로모터를 의미함 표 B. subtilis P450 유전자의 natural mutations 표 S. lycopersicum G6PDH 유전자의 클로닝, 대장균에서의 발현 및 NADPH-P450 효소활성에 대한 G6PDH의 효과 표 Bacillus P450 활성 HTS system 개발 표 Human P450 monooxygenase 활성을 가지는 whole-cell biocatalyst 제조 요약 표 분리된 B. velezensis의 2차 대사 물질 합성 유전자 표 B. subtilis 168과 45-1 유래의 uricase를 B. subtilis WB800에서 발현 표 (A) pucL knock-out 균주와 과발현 균주의 uric acid 분해 능력. (B) B. subtilis에서 oxdC 유전자의 발현 표 Screening된 promoter에 의한 cat 유전자 발현 양상 표 Screening promoter의 identification 및 p43과의 상대적인 transcription level 표 ATCC6501로부터 제거한 유전자 list 표 제작된 군주의 growth curve 표 B. subtilis 76-1 기반 Δprotease 균주의 lactase 발현 양상 표 In silico leader screening을 전략 표 선택된 leader sequence를 coding 하는 DNA 서열들의 codon context fitness와 RNA stability 표 NRPS and PKS gene clusters of B. velezensis GF423 표 Detection of macrolactin genes in Bacillus amyloliquefaciens group strains 표 GFP production showing the tranformation in B. velezensis strains 표 (a) Anti-allergic effects of cellular protein fractionates of Bacillus velezensis. (b) SDS-gel pattern from the active fractions 표 Identification of active fraction proteins in Bacillus strains 표 Anti-allergy effect in OVA induced mouse model of spore and other anti-allergy components 표 황색 pigment 생산성이 향상된 돌연변이주의 phenotype 및 genotype 분석 표 Total pigment analysis in mutant 표 Single colony isolation plate에서의 균주 다양성. 3차에 걸친 90명의 대변으로부터 분리된 spore 형성균 콜로니 표 Human faces에서 분류한 Bacillus의 16s rRNA BLAST 결과 표 Differences of antibiotic production diversities among B. amyloliquefaciens species 표 Reclassified B. amyloliquefaciens group species based on the antibiotic production 표 분리 Bacillus 균주의 항산화 활성 표 EV proteome list of B. velezensis GF423 strain (shown, partial data)
표 Restriction-modification 시스템의 분류 (Sistla 2004) 표 Bacillus 균의 R-M 시스템 요약 (REBASE) 표 B. subtilis의 R-M 시스템 확인 표 효모의 in vivo assembly 모식도 표 DNA MTase의 one step cloning을 위한 벡터 map 표 B. subtilis 168과 KCTC1028에서 형질전환 효율 검정 표 B. subtilis의 형질전환 기작. (A) natural competence 모식도 (http://2014.igem.org/Team:Calgary/Project/BsDetector/BsChassis). competence와 관련된 Com regulon을 이용하여 세포 밖에 존재하는 DNA를 세포 내로 도입시킴. (B) electroporation 모식도 (Du, et al. 2018). 순간적인 전기 충격을 통해 세포막의 투과성을 변화시켜 외부 DNA를 도입시킴 표 (A) EBC donor cell 모식도. 염색체 내로 삽입시킨 플라스미드 RP4의 conjugative machinery 도움을 받아 원하는 플라스미드를 recipient cell로 도입시킴. (B) BBC donor cell 모식도. 플라스미드 pLS20의 conjugative machinery 도움을 받아 원하는 플라스미드를 recipient cell로 도입시킴 표 야생형 B. subtilis 균주에서 여러 형질전환 방법에 따른 효율 비교. x축에서 168은 B. subtilis 168을, 나머지 숫자는 KCTC에서 분양받은 균주 번호를 의미함 표 MICE 시스템 모식도. (A) ICE와 MICE의 유전적 인자 비교. (B) ICE와 MICE의 DNA 전달 기작 표 (A) MICE 형질전환 효율 확인 및 (B, C) 야생형 B. subtilis 균주들의 GFP 활성 비교 표 야생형 B. subtilis 균주에서 GFP 발현 확인 표 QPS Bacillus 균주들에서 GFP 활성 확인 표 CRISPR-Cas9을 사용한 multiple gene editing 과정 표 Self-targeting gRNA에 의한 plasmid self-curing 효율 확인 (A) Self-curing 검증을 위해 제작된 플라스미드. sgRNAst과 sgRNAct는 각각 self-targeting, chromosome-targeting을 위한 sgRNA를 의미함. (B) 플라스미드 curing 효율 확인 표 B. subtilis에서 연속적인 genome editing 모식도 표 Programmed gRNA removal system을 이용한 B. subtilis에 있는 8개의 세포 외 단백질 분해 효소 (extracellular protease)의 순차적인 유전자 결실 (A) Mutation 및 plasmid curing 효율 확인 (B) FTC-casein을 이용한 protease assay 결과 표 특정 위치의 시토신(C)을 티민(T)으로 전환시키는 cytosine base editing의 모식도 표 B. subtilis을 위한 cytosine base editor (CBE) 시스템 개발 (A) 최적화된 CBE 선별을 위한 제작된 네 종류의 플라스미드 (B) CBE 효율 검증을 위한 GFP 형광 유전자 표적 gRNA 설계 (C) 각 CBE 플라스미드의 효율 확인 표 CBE4의 editing window 확인 (A) 편집 범위 확인을 위해 선정된 6개의 gRNA의 위치 및 서열 (B) 각 시토신 위치에서의 평균 돌연변이 효율 표 CBE4 매개 multiplex genome editing의 효율 및 off-target 영향 (A) 다중 동시 표적에 따른 돌연변이 효율 확인 (B) Protease 표적 균주에 대한 protease assay 결과 (C) CBE4에 의해 제작된 돌연변이 균주 genome 내의 nucleotide 변화 확인 (D) 돌연변이 균주별 off-target에 따른 유의미한 아미노산 변화의 수 표 cry3Aa 프로모터 변이체, CRE 공통염기서열, gfp 유전자를 포함한 플라스미드 도식 표 CRE 염기 서열을 포함하는 cry3Aa 프로모터 변이체들을 도입시킨 Bacillus 균주의 GFP 발현양 비교. (A) pDC5D: CRE 염기서열을 포함하지 않는 cry3Aa 프로모터, (B) pDC5DCF: –35 앞에 CRE 염기 서열이 위치한 cry3Aa 프로모터, (C) pDC5DCM: –35과 -10 사이에 CRE 염기 서열이 위치한 cry3Aa 프로모터, (D) pDC5DCB1: –10 뒤에 1개의 CRE 염기서열이 위치한 cry3Aa 프로모터, (E) FB1; pDC5DCF-4와 pDC5DCB1-1의 CRE 염기 서열을 합친 cry3Aa 프로모터, MB1; pDC5DCM-3과 pDC5DCB1-1의 CRE 염기 서열을 합친 cry3Aa 프로모터를 의미함. LBG2; 2% 포도당이 첨가된 LB 배지를 의미함. (F) 단백질 전기영동으로 각 형질전환체들의 GFP 발현량을 확인하였음. -; 포도당 무첨가, +; 포도당 첨가를 의미함 표 CRE 염기 서열을 포함하는 cry3Aa 프로모터 변이체들을 도입시킨 Bacillus 균주의 GFP 발현양 비교. (A) pDC5DCB1; –10 부위 뒤에 1개의 CRE 공통염기서열을 포함한 cry3Aa 프로모터, (B) pDC5DCB2; –10 부위 뒤에 2개의 CRE 공통염기서열을 포함한 cry3Aa 프로모터, (C) pDC5DCB4; –10 부위 뒤에 4개의 CRE 공통염기서열을 포함한 cry3Aa 프로모터 LBG2는 포도당이 2% 첨가된 LB 배지를 의미함 표 (A) pDC5DB1, (B) pDC5DB2, (C) pDC5DB4 라이브러리 중 상위 10개 균주들의 GFP 활성 비교. (D) 선정된 프로모터 변이체의 포도당에 의한 발현 억제 비율 표 단백질 전기영동으로 pDC5DCB4 라이브러리 중 상위 10개 균주의 GFP 발현량 확인. LBG2는 포도당이 2% 첨가된 배지를 의미함 표 P450의 발현 여부를 단백질 전기영동으로 확인. P5D; CRE 염기서열을 포함하지 않는 cry3Aa 프로모터, P5DCB4; –10 부위 뒤에 4개의 CRE 공통염기서열을 포함한 cry3Aa 프로모터를 의미함 표 B. subtilis P450 유전자의 natural mutations 표 S. lycopersicum G6PDH 유전자의 클로닝, 대장균에서의 발현 및 NADPH-P450 효소활성에 대한 G6PDH의 효과 표 Bacillus P450 활성 HTS system 개발 표 Human P450 monooxygenase 활성을 가지는 whole-cell biocatalyst 제조 요약 표 분리된 B. velezensis의 2차 대사 물질 합성 유전자 표 B. subtilis 168과 45-1 유래의 uricase를 B. subtilis WB800에서 발현 표 (A) pucL knock-out 균주와 과발현 균주의 uric acid 분해 능력. (B) B. subtilis에서 oxdC 유전자의 발현 표 Screening된 promoter에 의한 cat 유전자 발현 양상 표 Screening promoter의 identification 및 p43과의 상대적인 transcription level 표 ATCC6501로부터 제거한 유전자 list 표 제작된 군주의 growth curve 표 B. subtilis 76-1 기반 Δprotease 균주의 lactase 발현 양상 표 In silico leader screening을 전략 표 선택된 leader sequence를 coding 하는 DNA 서열들의 codon context fitness와 RNA stability 표 NRPS and PKS gene clusters of B. velezensis GF423 표 Detection of macrolactin genes in Bacillus amyloliquefaciens group strains 표 GFP production showing the tranformation in B. velezensis strains 표 (a) Anti-allergic effects of cellular protein fractionates of Bacillus velezensis. (b) SDS-gel pattern from the active fractions 표 Identification of active fraction proteins in Bacillus strains 표 Anti-allergy effect in OVA induced mouse model of spore and other anti-allergy components 표 황색 pigment 생산성이 향상된 돌연변이주의 phenotype 및 genotype 분석 표 Total pigment analysis in mutant 표 Single colony isolation plate에서의 균주 다양성. 3차에 걸친 90명의 대변으로부터 분리된 spore 형성균 콜로니 표 Human faces에서 분류한 Bacillus의 16s rRNA BLAST 결과 표 Differences of antibiotic production diversities among B. amyloliquefaciens species 표 Reclassified B. amyloliquefaciens group species based on the antibiotic production 표 분리 Bacillus 균주의 항산화 활성 표 EV proteome list of B. velezensis GF423 strain (shown, partial data)
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