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문제 정의
- 본 연구에는 식물추출물 (이흐} Saururus chinensis, 일명: 삼백초)을 이용, 매년 여성의 사망 원인 암 중에서 1, 2위로 알려진 자궁경부암 바이러스S인 파필로마바이러스 암유발인자 E6 와 E7의 작용기전에 미치는 효과를 연구하였다. 암 발생원인 중에서는 세포성 암 유전자들 (예: c-myc, ras 등)'佬)과 바이러스성 암 유전자들(예: EBV HPV HBV 등)이 발견되었고 이들 유전자나 유전자 변이들 그리고 암 발생과의 관련성 및 기작에 관한 많은 연구 논문들이 발표되어 왔다.
- 인두유종바이러스(HPV) 16형 및 18 형과 사궁경부암과의 긴밀한 관련성은 잘 알려져 있다. 본 연구에서;- 식물추출물, 일명 삼백초 (eSaururus chinensis)7\ HPV 16枣 2 E6, E7 발암유전자의 기능 및 발현을 억제하는지 여부를 즈.정하였다.
가설 설정
- 최근에 이 구조로부터 결합된 ZiF+를 방출하거나 결합부위를 불활성화 시킴으로사 E&를 대상으로 하는 새로운 항암제를 검색하는 방법이 시도되었다.25)E7 단백질도 E6와 같이 zinc-finger 구조를 가지고있어 Saururus chinensise} zinc-finger 구?:루부터 ZrF+를 방줄하거나 구조를 불활성 할 수도 있을 것으로 사료된다.
제안 방법
- 24)Fig. 1에서 보듯이 HPV 양성 세포주에 Saururus 渤泌疝의 효과가 가장 높았기 때문에 HPV의 2개의 발암 유전자인 E6와 E7의 세포 내 단백질, 즉 E6AP 및 Rb의 결합 및 그들의 발현 조절에 미치는 영향을 조사했다 (Fig. 1).
- p53 발현 단백질을 측정하기 위해, PE-46을 처리한 SiHa 세포에서 단백질을 추출한 후, 12% SDS-MGE로 전기영동한 후, PVDF membrane으로 transfer하였다. 3% skimmed milk를 함유한 PBS로 1: 500 배희석시킨 p53특이항체 (monoclonal anti-p53 antibody, Ab-6, Oncogene, Boston, MA)를 1시간 처리한 후 0.05% lween-20 을 함유한 PBS (PBST)로 3 번 세척한 후 anti mouse IgG- Alkaline phosphatase conjugate (Sigma, St. Louis, MI)를 45 분 반응시켰다. PBST로 충분히 3 번 세척한 후, 발색시약 NBT/ BCIP (Bio Rad Lab» 넣어 발색시켰다.
- 5, 25, 50, 100 |ig/m/ 씩 되게 넣은 후 1시간 실온에서반응시켰다. E6AP에 결합한 E6는 mouse anti-E6 antibody 와 horseradish phosphatase-conjugated anti-mouse IgG (Sigma) 를 처리하였고, E7에 결합한 Rb는 mouse anti-Rb antibody (Ab- 6) (Oncogene) 와 horseradish phosphatase-conjugated antimouse IgG (Sigma)를 처리하였다. 반응 후 PBST로 세척하고기질용액(4 mg o-phenylene-diamine, 5 |ig 37% H2O2 per 10 ml of 0.
- ELISA를 이용한 E6-E6AR E7-Rb bin曲 assay- 분리 정제한 E6AP와 E7을 각각 다른 Maxisorb 96-well plate에 각각 10(ig/m/과 4 μg/mZ로 coating한 후 PBS/3% skimmed milk로 2 시간 동안 blocking 하였다. PBST (phosphate-buffered saline 에 0.
- 제조되었다. HPV 함유 자궁경부암 세포인 CaSki의 RNA로부터 다음과 같은 primer (5'-CAC CAT GGC ATG GCA TGG AGA TAC ACC T-3과 5-TTA TGG TTT CTG AGA ACA-3)를 사용하여 RT-PCR을 수행 증폭하였다. 이 증폭산물을 T-vector에 연결하고 다시 BarnR I과 Sal L으로 절단하여 E7 유전자를 획득하였다.
- Histidine] 결합된 E6AP를 발현하기 위해 TOPO/E6AP를 Bgl II와 Hind m로 절단하고 pET28은 BamB. I과 Hind IU로 절단하여 ligase로 조합하였다.2%
- 시간 동안 blocking 하였다. PBST (phosphate-buffered saline 에 0.05% Tween 20)로 3 번 세척 후 PBST게 10 배 희석한 E6 lysate는 E6AP coating well에, PBST에 16 배 희석한 Rb lysate는 E7 coating well에 넣고, Saururus chi*, zsis를 3.15, 6.3, 12.5, 25, 50, 100 |ig/m/ 씩 되게 넣은 후 1시간 실온에서반응시켰다. E6AP에 결합한 E6는 mouse anti-E6 antibody 와 horseradish phosphatase-conjugated anti-mouse IgG (Sigma) 를 처리하였고, E7에 결합한 Rb는 mouse anti-Rb antibody (Ab- 6) (Oncogene) 와 horseradish phosphatase-conjugated antimouse IgG (Sigma)를 처리하였다.
- p53 primers; S-CGT-GAG-CGC-TTC-GAG-ATG-TTC- C-3 (sense), 5'-TGG-GAA-GGG-ACA-GAA-GAT-GAC-AGG-3' (antisense). Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)은 RT-PCR kit (Stratagene)를 이용, 전 항에서 기술한 바와 같이 동일하게 수행하였다. p53 발현 단백질을 측정하기 위해, PE-46을 처리한 SiHa 세포에서 단백질을 추출한 후, 12% SDS-MGE로 전기영동한 후, PVDF membrane으로 transfer하였다.
- Saururus chinensis 추출물 PE-46 CHI 의한 p53 tumor suppressor의 mRNA 및 단백질의 발현에 미치는 영향 - 전 항에서 기술한 바와 같이 PE-46을 처리한 SiHa 세포에서 total RNA 및 단백질을 추출하여 RT-PCR 및 Western blot을 수행하였다. p53 primers; S-CGT-GAG-CGC-TTC-GAG-ATG-TTC- C-3 (sense), 5'-TGG-GAA-GGG-ACA-GAA-GAT-GAC-AGG-3' (antisense).
- Saururus chinensis 추출물 PE-460II 의한 HPV E6, E7 oncogene의 mRNA 발현에 미치는 영향 -DMEM/10% FBS에유지시킨 HPV 16 genome을 지니고 있는 자궁경부암 세포주 SiHaf- 100 mm petri dish에 5xl05/10 m/씩 넣은 후 1일 동안 CO2 incubator에 배양하였다. 새로운 배지로 갈아준 후 40 卬以 ml 농도로 희석시킨 Saururus chinensis를 처리하고 20시간 후 total RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다.
- Saururus chinensis 추출물 PE-46가 HPV oncogene E6, E7 mRNA level에 미치는 영향 - Saururus chinensis가 E6와 E7 mRNA의 발현에 미치는 영향을 보기 위해 RT-PCR을 수행하였다 (Fig. 4). Fig.
- Saururus 사而ensi奔출물 PE-4671- 세포주기에 미치는 영향 - Saururus chinensis 주줄물 PE-46가 세포주기에 미치는 영향을 보기 위해 Saururus chinensis를 처리한 세포와 처리하지 않은 세포 (DMEM/10% FBS河서 유지)의 세포주기 분포는 DNA 를 PI (propidium iodide)로 염색한 후 FACS 분석으로 비교하였다 (Fig. 6). Saururus 를 처리한 세포에서는 S-phase 상태의 세포가 18.
- 0의 50 mM NaH2PO4> 300 mM NaCl, 10 mM ImidazoleS. 구성된 용해완충용액 (0.5 mM phenylmethyl sulfonyl fluride 과 10 ng/m/의 aprotinin 함유)에 용해시키고 초음파 파쇄를 실시하였다. 이를 원심분리하고 상액만을 취하여 결합 반응에 사용하였다.
- 35 山 증류수}을 37℃에서 1시간 반응시켜 얻은 다음-, primer 와 함께 중합반응을 계속시켜 (94℃에 1 분, 60℃ 에 1 분, 그리고 72℃에서 1 분 30 초 반응을 30 번 반복) PCR products를 얻어 1% agarose gel로 확인하였다. 동량의 RNA 사용 여부를 확인하기 위해, house keeping gene인 GAPDH을 측정하고자 GAPDH primer를 다음과 같이 사용하였다; 5'-AGA ACA TCA CAT CAG GAT TCC TAGG-3' (sense), 5'-CTA GTA TGC CCT GAG CCT GAG-3' (antisense).
- PCR 산물은 pBluescript H KS(+)로 제조된 T-vector2】세 옮긴 후 이 E6 유전자를 다시 제한효소 BamH I과 Sal L으로 절단하고 똑같은 효소로 절단한 PGEX4T-1 과 pET28a 벡터에 연결하였다. 또한 E6AJ는 가운데 부분이 중복되는 2 종류의 primer (5'-AGA TCT ATG AAG CGA GCA GCT GCA AA GCA TCT AAT A-31 과5'-CTC TAG CCG GAC AAG TGC ATC ATC TAT GAT-3', 5'-AGC GAG CTG ACA CTT CAG GAA CTT TTG GGA-3' 과 5'- TTA CAG CAT GCC AAA TCC TTT GGC ATA CGT-3)를사용하여 앞에서와 같은 방법으로 RT-PCR로 증폭하였다. 이 증폭된 산물은 cloning 벡터인 PCR® 2.
- 배양하였다. 새로운 배지로 갈아주고 여러가지 농도로 희석시킨 Saururus ch论㎛sis를 처리한 다음 24시간 후 WST-1 reagent (Roche, Germany) 10 p/를 첨가하여 1-3 시간 이내에 450-650 nm에서 흡광도를 ELISA reader (Molecular Device, CA)로 측정하였다.
- incubator에 배양하였다. 새로운 배지로 갈아준 후 40 卬以 ml 농도로 희석시킨 Saururus chinensis를 처리하고 20시간 후 total RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다. E6 primers; 5'- GCG GCC GCC ACC ATG TTT CAG GAC CAC AG-3 (sense), 5'-CTG CGG CCG CGA TTA CAG CTG GGT TTT CTCT-3' (antisense), E7 primers; 5-GCG GCC GCC ACC ATG GCA TGG CAT GGA GAT ACA CCT-3' (sense), 5'- AGG CGG CCG CGA TTA TGG TTT CTG AGA ACA-3' (antisense).
- incubator에 배양하였다. 새로운 배지로 갈이준 후 40 |ig/mZ의 농도로 Saururus chinensis을藉 처리한 다음 24시간 후 trypsir을 처리하여 세포를 수확하였다. 수확한 세포를 PBS (phosphate-buffered saline)로 2번 세척하고 70% EtOH 1 m/로 -20℃ 에서 12 시간 고정하고 난 후 PBS로 2 번세척하였다.
- 수확한 세포를 PBS (phosphate-buffered saline)로 2번 세척하고 70% EtOH 1 m/로 -20℃ 에서 12 시간 고정하고 난 후 PBS로 2 번세척하였다. 세포주기 분포는 PI (propidium iodide)로 DNA를 염색한 후 FACS 분석을 사용하여 DNA content를 측정하였다.
- 또한 E6AJ는 가운데 부분이 중복되는 2 종류의 primer (5'-AGA TCT ATG AAG CGA GCA GCT GCA AA GCA TCT AAT A-31 과5'-CTC TAG CCG GAC AAG TGC ATC ATC TAT GAT-3', 5'-AGC GAG CTG ACA CTT CAG GAA CTT TTG GGA-3' 과 5'- TTA CAG CAT GCC AAA TCC TTT GGC ATA CGT-3)를사용하여 앞에서와 같은 방법으로 RT-PCR로 증폭하였다. 이 증폭된 산물은 cloning 벡터인 PCR® 2.1-TOPO에 연결하고 Bgl II 와 EcoR I으로 절단한 다음, BamH I과 EcoR I으로 절단한 PGEX4T-1 에 cloning하였다. Histidine] 결합된 E6AP를 발현하기 위해 TOPO/E6AP를 Bgl II와 Hind m로 절단하고 pET28은 BamB.
- 재조합 단백질 대량생산 -pET/Rb 발현 벡터가 들어간 E. coli (DH5a)와, pET28a/E6, pET28a/E7와 pET28a/E6AP가 들어간 E. coli (DE3)를 대량 배양하여 ] mM isoprophyl-b-D-thiogala- ctopyranoside (IPTG)가 되게 첨가한 후 18℃에서 12 시간 동안 단백질을 유도하였다. 숙주세균은 원심분리하여 얻었고, 발현대장균은 pH 8.
- Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)은 RT-PCR kit (StratageneX 이용하여 수행하였다. 즉, cDNA는 25 W 반응액 [2.5 山 10X first-strand buffer, 2 100 mM dNTPs, 0.15 B MMEV-RT (50 U/l), 2 也 RNA, 16.35 山 증류수}을 37℃에서 1시간 반응시켜 얻은 다음-, primer 와 함께 중합반응을 계속시켜 (94℃에 1 분, 60℃ 에 1 분, 그리고 72℃에서 1 분 30 초 반응을 30 번 반복) PCR products를 얻어 1% agarose gel로 확인하였다. 동량의 RNA 사용 여부를 확인하기 위해, house keeping gene인 GAPDH을 측정하고자 GAPDH primer를 다음과 같이 사용하였다; 5'-AGA ACA TCA CAT CAG GAT TCC TAGG-3' (sense), 5'-CTA GTA TGC CCT GAG CCT GAG-3' (antisense).
- 또한 E7 발암 유전자는 E2F와 결합하고 있는 Rb를 인산화시켜 E2E ] 유리되도록 함은 E2F에 의한 세포주기가 활성화되어 정상세車암화 되는데 중요한 역할을 한다.紬 본 연구에서는 삼백초 추출물 {Saururus c加, 이 자궁경부암 바이러스인 파필로" 바이러스 암 유발인자 E6와 E7의 작용을 억제하는 효과를 흐, !!하고 항 바이러스, 항암활성효과의 기작을 이해하기 위하& 이들 추출물의 자궁암 세포주에 대한 세포독성과 암을 일으키 -=■ ■前이러스 발암유전자 E6와 E7의 작용에 미치는 효과를조사技 였다.
대상 데이터
- E6와 E6AP 발현 벡터 제조 - 본 실험에서 사용되는 E6와 E6AP- pGEX 및 pET28a 벡터에서 발현되도록 제조하였다. E6 는 EI V 함유 자궁경부암 세포로부터 추출한 RNA로부터 5-GCG GCC ;CC ACC ATG TTT CAG GAC CAC AG-3'(sense) 와 5'-CT(; CGG CCG CGA TIA CAG CTG GGT TTT CTC T-3' 応 ntisense)의 primer를 사용하여 역전사 polymerase chain reactic n (PCR)을 수행하여 증폭하였다.
- E74 Rb 발현 벡터 제조 -E7 단백질은 histidine결합과 GST 결합형태로 제조되었다. HPV 함유 자궁경부암 세포인 CaSki의 RNA로부터 다음과 같은 primer (5'-CAC CAT GGC ATG GCA TGG AGA TAC ACC T-3과 5-TTA TGG TTT CTG AGA ACA-3)를 사용하여 RT-PCR을 수행 증폭하였다.
- 이들에 관한 연구는 종양바이러스에 의해 유도되는 암의 발암 기작을 연구핱 -r 있을 뿐만 아니라 아직까지 주요 원인이 밝혀지지 않은타종 암이 대해 많은 정보를 제공할 수 있을 것이다. 일례로 SV40 바이:? 스의 large T antigen과 HPV E6 단백질은 p53 단백질의기능寻 억제하고 있음이 밝혀졌는데18)정상적으로 p53을 나타내는 세고에 HPV E6 발현을 유도하면 세포증식이 촉진되고 있음이 害혀졌다.询 p53 단백질은 대부분의 암 조직에서 유전자 돌연변c 에 의해 발현이 안되거나 그 기능이 상실되어 있으며 암의 종류에 따라 돌연변이의 형태도 각기 다름이 알려졌다.
이론/모형
- E6 primers; 5'- GCG GCC GCC ACC ATG TTT CAG GAC CAC AG-3 (sense), 5'-CTG CGG CCG CGA TTA CAG CTG GGT TTT CTCT-3' (antisense), E7 primers; 5-GCG GCC GCC ACC ATG GCA TGG CAT GGA GAT ACA CCT-3' (sense), 5'- AGG CGG CCG CGA TTA TGG TTT CTG AGA ACA-3' (antisense). Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)은 RT-PCR kit (StratageneX 이용하여 수행하였다. 즉, cDNA는 25 W 반응액 [2.
성능/효과
- 이 Saururus ㎛初ensi는 자궁경부암 세포주 (C- 33A, SiHa, CaSki)와 HaCaT keratinocytes의 증식을 농도 의존적으土 억제하였다. ELISA (효소면역측정법)결과, Saururus chimnsis 7} 암억제인자인 p53과 결합하여 분해시키는데 필수적인 E6와 E6AP와의 결합을 억제할 뿐만 아니라 암 억제인자 Rb 와 E7과의 결합을 억제하였다. RT-PCR에 의한 실험결과는 Sauniiis chinensise 의해 E6Q* E7 mRNA의 level이 감소하였음을 貝6 주었다.
- 4). Fig. 4에서 나타내듯이 처리하지 않은 세포에 비교해 Saururus di讪ensis를 처리한 세포에서는 HPV oncogene 인 E6와 E7의 mRNA level이 저해됨을 확인할 수 있었다. 결론적으로 Saururus chinensise E6와 E7의 전사를 감소시키고 또한 E6-E6AP 및 E7-Rb 결합반응을 방해하여 세포의 불멸화에필요한 세포내의 단백질의 변화를 억제함으로써 HPV 양성인 자궁경부암 세포에 특이적으로 독성을 나타낼 수 있을 것으로 사료된다.
- 4), PE-4G을 처리한 SiHa 세포에서 total RNA 및 단백질을 추출하여 p53 level에도 영향을 미치는지 RT-PCR 및 Western blot로확인하였다. RT-PCR 및 Western blot 결과 모두 PE-46 처리 시, p53 발현에는 별 영향을 끼치지 않는 것으로 나타났다 (Fig. 5). 이 결과 PE-46는 p53과 무관하게 E6 oncogene levek을 억제하는 것으로 사료되었다.
- Saururus chinensis Saururus chinensis 추출물 PE-4671- E6AP와 E6의 binding에 미치는 영향 -Saururus ch泌ensis가 E6AP와 E6의 결합에 미치는 영향을 보기 위해 ELISA를 수행한 결과 Saururus c知渺isis가 E6AP와 E6의 결합을 농도 의존적£上 억제하였다 (Fig. 2). 이 경우 Saururus 사ii*nsis를 약 100 卜g/mZ 첨가하였을 때 확실한 억제효과를 나타내었다.
- Saururus chinensis 추출물 PE-467 F E7과 Rb의 결합에 미치는 영향 - Saururus chinensis가 E7과 Rb의 결합에 미치는 영향을 보기 위해 ELISA를 수행한 결과 Saururus chinensise} E7 과 Rb의 결합을 농도 의존적으로 억제하는 것을 알 수 있었다 (Fig. 3). 이때 Saururus c/h初o?sis를 100첨가하였을 때 ELISA에서 현저한 억제효과를 나타내었다 (Fig.
- 4에서 나타내듯이 처리하지 않은 세포에 비교해 Saururus di讪ensis를 처리한 세포에서는 HPV oncogene 인 E6와 E7의 mRNA level이 저해됨을 확인할 수 있었다. 결론적으로 Saururus chinensise E6와 E7의 전사를 감소시키고 또한 E6-E6AP 및 E7-Rb 결합반응을 방해하여 세포의 불멸화에필요한 세포내의 단백질의 변화를 억제함으로써 HPV 양성인 자궁경부암 세포에 특이적으로 독성을 나타낼 수 있을 것으로 사료된다.
- 丄 E7과 Rb가 결합을 저해해 p53과 Rb의 정상적인 기능을하거 司& E2F 전사인자의 활성을 조절하여 세포주기의 정상적인 M댕을 지연하는 것으로 생각된다. 본 실험에 의하면 p53의발혼>1 는 변화가 없는 것으로 나타나 (Fig. 5), p53과 무관하게 E6 발甘유전자의 발현을 억제하는 것으로 사료된다. 따라서 이들 긑;:牛에 의하면 Saururus ch初tensis가 HPV 16형의 E6와 E7 의 발암성을 억제하는 것으로 사료되기 때문에 HPV에 의해 유도된 사궁경부암의 치료에 유효할 것으로 기대됨으로 좀 더 자세한 tn iitro 및 in vivo 실험 등이 요구된다.
- 5). 이 결과 PE-46는 p53과 무관하게 E6 oncogene levek을 억제하는 것으로 사료되었다.
- 48%가 각각 S와 GO/Gl-phase 이었己. 이러한 결과는 Saururus c/izR次is가 HPV oncogeneQ1 E6와 36AP 또한 E7과 Rb의 결합을 저해해 tumor suppressor 의 ;' 与을 회복시킴으로써 E2F 전사인자의 활성을 조절하여 세포주, 의 정상적인 진행을 지연하는 것으로 사료된다.
- 자궁경부암 세포주의 세포독성 - 자궁경부암 세포주 C-33A, CaSki, SiHa와 keratinocyte세포 HaCaT에 Saururus chinensis 를 농도별 800 까지 처리한 결과 CaSki 와 SiHa 에서는 농도 의존적으로 민감한 세포독성을 보여 세포의 성장이 현저하게 감소하는 것을 볼 수 있었다. 자궁경부암 세포주 중에서도 HPV 가 아닌 다른 원인에 의해 암세포화된 C-33A 와 keratinocyte HaCaT 에서는 세포독성이 나타나지 않았다 (Fig.
후속연구
- 5), p53과 무관하게 E6 발甘유전자의 발현을 억제하는 것으로 사료된다. 따라서 이들 긑;:牛에 의하면 Saururus ch初tensis가 HPV 16형의 E6와 E7 의 발암성을 억제하는 것으로 사료되기 때문에 HPV에 의해 유도된 사궁경부암의 치료에 유효할 것으로 기대됨으로 좀 더 자세한 tn iitro 및 in vivo 실험 등이 요구된다.
- 한편인체。발생하는 전체 암의 15~20%가 바이러스와 연관되어 있는 것2로 이미 밝혀져 있어 원인 바이러스를 분리하거나 분리된 1斗기러스의 DNA로부터 단백질을 만들어 내어 백신으로 사용하나 진단법에 이용하는 연구가 이루어지고 있다. 이들에 관한 연구는 종양바이러스에 의해 유도되는 암의 발암 기작을 연구핱 -r 있을 뿐만 아니라 아직까지 주요 원인이 밝혀지지 않은타종 암이 대해 많은 정보를 제공할 수 있을 것이다. 일례로 SV40 바이:? 스의 large T antigen과 HPV E6 단백질은 p53 단백질의기능寻 억제하고 있음이 밝혀졌는데18)정상적으로 p53을 나타내는 세고에 HPV E6 발현을 유도하면 세포증식이 촉진되고 있음이 害혀졌다.
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