[논문]녹용 물 추출물의 파골세포 분화 억제효과

곽한복; 김주호; 김동주; 권영미; 오재민; 김윤경

[국내논문] 녹용 물 추출물의 파골세포 분화 억제효과
Effect of Water Extract of Deer Antler in Osteoclast Differentiation 원문보기

동의생리병리학회지 = Journal of physiology & pathology in Korean Medicine, v.22 no.4, 2008년, pp.891 - 895

곽한복 (원광대학교 의과대학 해부학교실 의과학 연구소) , 김주호 (원광대학교 약학대학 한약학과 원광한약연구소) , 김동주 (원광대학교 의과대학 해부학교실 의과학 연구소) , 권영미 (원광대학교 한의과대학 진단 방사선학과) , 오재민 (원광대학교 의과대학 해부학교실 의과학 연구소) , 김윤경 (원광대학교 약학대학 한약학과 원광한약연구소)

Abstract ▼ AI-Helper

Natural substances have recently received much attention as therapeutic drugs to prevent many diseases in humans because they avoid the many side effects of treatment with chemical compounds. We examined the effect of water extract of deer antler in RANKL-induced osteoclast differentiation. The effects of water extract of deer antler in osteoclast differentiation were determined by culture of bone marrow macrophages (BMMs). The mRNA expression levels of c-Fos, NFATc1, TRAP, and GAPDH in BMMs were analyzed by RT-PCR. Cell lysates were obtained from the treated cells, the expression levels of c-Fos and NFATc1 were determined by western blotting with antibodies for c-Fos and NFATc1. Water extract of deer antler greatly inhibited RANKL-mediated osteoclast differentiation in osteoclast precursors without cytotoxicity. Water extract of deer antler inhibited the expression of c-Fos and NFATc1 in BMMs treated with RANKL. Our findings suggest that water extract of deer antler inhibited osteoclast differentiation by suppressing c-Fos and NFATc1 expression in response to RANKL. These results demonstrate that water extract of deer antler may be a useful the treatment of bone-related disease such as osteoporosis.

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문제 정의

최근에는 녹용 chroloform 추출물이파골세포의 분화 및 기능을 억제한다고 보고되었다14). 따라서 우리는 RANKLE] 의한 파골세포의 분화에 녹용 물 추출물의 효과를 검증하였고 억제 작용기전을 규명하고자 하였다.
우리는 녹용 물 추출물의 효과가 독성에 의한 비 특이적인 효과인지를 알아보기 위하여 대식세포를 이용하여 본 연구에서 사용한 녹용 물 추출물의 농도의 독성을 검증하였다. M-CSF만 처리한 대식세포와 녹용 물 추출물을 같이 처리한 실험군과의 유의성은 없었다(Fig.
특히 녹용은 면역 질환 치료제로 많이 사용되며 관절염에 탁월한 효과를 보인다고 보고되었다끼. 따라서 우리는 골 소실 질환에 중요한 파골세포의 분화에 녹용 물 추출물의 효과를 검증하였다. 녹용 물 추출물은 농도 의존적으로 유의하게 파골세포의 형성을 억제하였다(Fig.
핵으로 이동한 NFATcle파골세포에 특이적인 유전자 TRAP, cathepsin K, calcitonin receptor, OSCAR등의 유전자 발현을 촉진 한다5). 따라서 우리는 녹용 물 추출물의 파골세포 억제 효과가 c-Fos와 NFATcl 발현과 관련이 있는지 확인하였다. 녹용 물 추출물은 RANKL에 의해 유도되는 c-Fos와 NFATcl의 발현을 억제하였다(Fig.
3). 이 결과로 c-Fos와 NFATcl 발현의 억제가 녹용 물 추출물의 파골세포 분화억제 작용기전과 관련 있음을 제안한다.

제안 방법

분리된 골수세포는 10% Fetal bovine serum (FBS), M-CSF (30 ng/ml)를 첨가한 a-rninirntirn essential medium (a-MEM)배지 에서 3일간 배양 후 부유 세포는 제거하고 부착된 세포를 대식세포 (bone marrow macrophages, BMMs)로 사용하였다. 대식세포는 M-CSF (30 ng/ml)와 RANKL (50 ng/ml)을 첨가한 배지에 녹용 물 추출물을 농도별로 처리하여 4일간 배양하였다. 4일간 배양한 세포는 TRAP 용액을 이용하여 염색하고 TRAP 양성 세포를 파골세포로 간주하였다.
대식세포는 M-CSF (30 ng/ml)와 RANKL (50 ng/ml)을 첨가한 배지에 녹용 물 추출물을 농도별로 처리하여 4일간 배양하였다. 4일간 배양한 세포는 TRAP 용액을 이용하여 염색하고 TRAP 양성 세포를 파골세포로 간주하였다.
방법에 따라 분리하였다. 분리한 RNA 1 pge oligo dT primer, dNTP, buffer, dithiothreitol, RNase inhibitor, Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 다음과 같은 primer를 이용하여 polymerase chain reaction (PCR) 증폭을 하였다.
c-Fos sense, 5, -CTGGTGCAGCCCACTCTGGTC-3, ; c-Fos antisense, 5, -CTTTCAGCAGATTGGCAATCTC-3, ; NFATcl sense, 5Z- CAACGCCCTGACCACCGATAG-3, ; NFATcl antisense, 5, -GGCTGCCTTCCGTCTCATAGT-3, ; TRAP sense, 5, -ACTTCCCCAGCCCTTACTAC-3, ; TRAP antisense, ^-TCAGCACATAGCCCACACCG-y; OSCAR sense, 5Z- CTGCTGGTAACGGATCAGCTCCCCAGA3 OSCAR antisense, 5Z- CCAAGGAGCCAGAACCTTCGAAACT-3'; GAPDH sense, 5, -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3, ; GAPDH antisense, 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'. PCR 후, 증폭된 cDNA는 1% agarose gel에서 전기영동하였고 Et-Br로 염색하여 U.V.상에서 관찰하였다.
PVDF 막은 5% skim milk를 2시간 처리하여 비특이 단백이 붙는 것을 차단하였다. 다시 PVDF 막에 c-Fos 또는 NFATcl 항체를 처 리하고 horseradish peroxidase 가 붙어있는 2차 항체를 처리한 후 enhanced chemiluminescence (ECL)을 사용해 단백 발현 정도를 확인하였다.
뼈 질환에 중요하게 작용한다. 우리는 파골세포의 분화에 녹용 물 추출물의 효과를 검증하기 위하여 대식세포에 M-CSF와 RANKL를 처리하고 녹용 물 추출물을 농도별로 처리하여 4일간 배양하였다. M-CSF와 RANKL을 처리한 대조군 세포는 TRAP 양성 다핵형 파골세포로 분화되었지만, 녹용 물 추출물을 처리한 실험군에서는 농도 증감에 따라 TRAP 양성 파골세포의 형성이 억제되었다(Fig.
특히 c-Fos는 파골세포 분화 초기단계에 중요한 전사인자로 NFATcl 발현을 촉진한다고 알려져있다5). 따라서 우리는 RANKL에 의한 c-Fos, NFATcl의 발현과 파골세포의 중요 인자인 TRAP과 OSCAR의 발현에 녹용 물 추출물의 효과를 검증하였다. RANKL는 c-Fos, NFATcl, TRAP, CSCAR mRNA의 발현을 촉진하였지만 녹용 물 추출물을 투여한 실험군 에서는 RANKL의 효과를 억제하였다(Fig.
우리는 전꾸세포인 대식세포가 RANKL에 의한 파골세포의 분화에 녹용 물 추출물의 효과를 검증하였다. 녹용 물 추출물은 세포 독성 없이 농도 의존적으로 파골세포로의 분화를 억제하였다.

대상 데이터

본 연구에 사용한 녹용(옴니 허브, 한국)은 물로 추출하여 감압농축한 후 똥결 . 건조하여 파우더 형태로 얻었다.
건조하여 파우더 형태로 얻었다. Human RANKL 과 Human M-CSF는 Peprotech (London, UK) 사의 제품을 사용하였다. XTT assay kit는 Roche (Indianapolis, IN, USA) 사에서 구입하였다.
XTT assay kit는 Roche (Indianapolis, IN, USA) 사에서 구입하였다. c-Fos와 NFATcl에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, US A)사에서 구입하였다. Actin 항체와 TRAP 용액은 Sigma Aldrich사에서 구입하였다.
c-Fos와 NFATcl에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, US A)사에서 구입하였다. Actin 항체와 TRAP 용액은 Sigma Aldrich사에서 구입하였다.
골수는 5주령 ICR 생쥐의 대퇴골과 경골에서 분리하였다. 분리된 골수세포는 10% Fetal bovine serum (FBS), M-CSF (30 ng/ml)를 첨가한 a-rninirntirn essential medium (a-MEM)배지 에서 3일간 배양 후 부유 세포는 제거하고 부착된 세포를 대식세포 (bone marrow macrophages, BMMs)로 사용하였다.

데이터처리

본 연구 결과는 3번 이상 반복 실험한 결과중 대표적인 결과를 보여주고 있으며 정 량적 인 결과는 평균 ± 표준편차로 표시하였다. 대조군과 실험군과의 통계 적 인 유의 성은 Student's t-test를 이용하여 분석하였고, P값이 0.
대조군과 실험군과의 통계 적 인 유의 성은 Student's t-test를 이용하여 분석하였고, P값이 0.05 이하인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

이론/모형

세포 내 RNA는 TRIzol (Invitrogen) 시 약을 사용하여 제조사의 방법에 따라 분리하였다. 분리한 RNA 1 pge oligo dT primer, dNTP, buffer, dithiothreitol, RNase inhibitor, Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen)를 사용하여 cDNA를 합성하였다.
우리는 RANKL에 의해 유도되는 c-Fos와 NFATcl 단백의 발현에 녹용물 추출물의 효과를 western blot 방법으로 검증하였다. RANKL 만 처리한 대조군은 시간 의존적으로 c-Fos와 NFATcl 단백 발현이 증가되었지만 녹용 물 추출물을 같이 처리한 실험군의 c-Fos 와 NFATcl 단백 발현은 대조군에 비하여 감소되었다(Fig.

성능/효과

우리는 파골세포의 분화에 녹용 물 추출물의 효과를 검증하기 위하여 대식세포에 M-CSF와 RANKL를 처리하고 녹용 물 추출물을 농도별로 처리하여 4일간 배양하였다. M-CSF와 RANKL을 처리한 대조군 세포는 TRAP 양성 다핵형 파골세포로 분화되었지만, 녹용 물 추출물을 처리한 실험군에서는 농도 증감에 따라 TRAP 양성 파골세포의 형성이 억제되었다(Fig. 1A and B).
따라서 우리는 RANKL에 의한 c-Fos, NFATcl의 발현과 파골세포의 중요 인자인 TRAP과 OSCAR의 발현에 녹용 물 추출물의 효과를 검증하였다. RANKL는 c-Fos, NFATcl, TRAP, CSCAR mRNA의 발현을 촉진하였지만 녹용 물 추출물을 투여한 실험군 에서는 RANKL의 효과를 억제하였다(Fig. 3).
우리는 RANKL에 의해 유도되는 c-Fos와 NFATcl 단백의 발현에 녹용물 추출물의 효과를 western blot 방법으로 검증하였다. RANKL 만 처리한 대조군은 시간 의존적으로 c-Fos와 NFATcl 단백 발현이 증가되었지만 녹용 물 추출물을 같이 처리한 실험군의 c-Fos 와 NFATcl 단백 발현은 대조군에 비하여 감소되었다(Fig. 4).
그러나 OPG의 결핍은 과도한 파골세포의 형성에 기인되어 골다공증 표현형을 나타낸다왜. 위의 결과로 RANKL, RANK, OPG는 골 발생과 재형성에 필수적인 인자로 알려졌다. RANK는 TNF receptor 계 열의 수용체로 TRAF 계 열 단백의 결합으로 Jun N-terminal kinase (JNK), p38/ extracellular signal-regulated kinase (ERK)와 같은 신호전달 물질의 활성화를통하여 파골세포 분화에 필수적 인 NF-kB, NFATcl, AP-1과 같은전사인자를 유도한다
따라서 우리는 녹용 물 추출물의 파골세포 억제 효과가 c-Fos와 NFATcl 발현과 관련이 있는지 확인하였다. 녹용 물 추출물은 RANKL에 의해 유도되는 c-Fos와 NFATcl의 발현을 억제하였다(Fig. 3). 이 결과로 c-Fos와 NFATcl 발현의 억제가 녹용 물 추출물의 파골세포 분화억제 작용기전과 관련 있음을 제안한다.
또핸 파골세포의 분화에 중요한 전사인자인 c-Fos와 NFATcl 의 발현을 의미 있게 억제하였다. 따라서 녹용 물 추출물은 RANKL에 의한 c-Fos와 NFATcl 발현의 억제로 파골세포의 분화를 억제시킴을 알 수 있다. 위 결과로 녹용 물 추출물은 골다공증 및 여러 뼈 질환 치료제 개발에 중요한 후보 물질로 사료된다.

후속연구

따라서 녹용 물 추출물은 RANKL에 의한 c-Fos와 NFATcl 발현의 억제로 파골세포의 분화를 억제시킴을 알 수 있다. 위 결과로 녹용 물 추출물은 골다공증 및 여러 뼈 질환 치료제 개발에 중요한 후보 물질로 사료된다.

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표제어: PCR

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용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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