본 연구는 서로 다른 host/vector system을 갖는 재조합 미생물을 이용하여 재조합 발효인자(세포성장, 단백질 농도, 세포 활성도, 플라스미드 안정성, β-lactamase 활성, IL-2 생성)에 대한 용존산소 농도의 영향을 조사하였으며 고농도 배양을 위하여 DO stat를 이용한 유가식 배양을 하여 IL-2의 생산성을 높이고자 시도하였으며 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 용존 산소 농도가 10-20%일 때 세포성장 및 단백질 농도가 가장 좋았으며 이것은 DO limitation과 비교하여 볼 때 약 20% 향상이 되었으며, IL-2를 생산하는 M5248/pNKM21 균주가 M5248/pBR322, M5248/pAS1 균주보다 외부 유전자의 발현에 의하여 세포성장 및 단백질 생성이 저해되었다. 2. 플라스미드 안정성은 호기적, 혐기적 상태가 DO limitation의 경우보다 그 안정성이 좋았다. 이것은 용존산소가 세포의 생리를 변화시켜 그 안정성이 증가된 것이라고 생각된다. 또한 β-lactamase 활성은 동일한 origin을 갖더라고 외래 유전자의 발현 정도 및 플라스미드 크기가 달라짐에 따라 서로 다른 활성을 보였으며 용존산소 농도의 증가는 β-lactamase 활성을 초래하였다. 3. 재조합 세포의 활성도는 30℃에서 배양시 세포성장 곡선과 마찬가지로 균주에 관계 없이 유사한 경향을 나타내나 42℃로 온도를 전이하면 M5248/pBR322, M5248/pAS1 균주는 정체상태로부터 서서히 생존 세포가 감소하나 IL-2를 생산하는 M5248/pNKM21은 온도 전이후 급격히 떨어지는 현상을 보여 외래 단백질의 발현이 세포내에 stress를 주기 때문일 것이라고 생각된다. 4. IL-2 생산량은 용존산소의 농도가 10-20%일 때 0.33 g/l으로 가장 높았으며 온도 전이시 air stop한 경우는 0.02 g/l로 IL-2 생산이 거의 없는 점으로 보아 용존산소의 농도가 외래 단백질의 발현에 큰 영향을 주는 인자임을 알 수 있다. 5. 고농도 배양시 주요 성장저해 대사산물은 ...
본 연구는 서로 다른 host/vector system을 갖는 재조합 미생물을 이용하여 재조합 발효인자(세포성장, 단백질 농도, 세포 활성도, 플라스미드 안정성, β-lactamase 활성, IL-2 생성)에 대한 용존산소 농도의 영향을 조사하였으며 고농도 배양을 위하여 DO stat를 이용한 유가식 배양을 하여 IL-2의 생산성을 높이고자 시도하였으며 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 용존 산소 농도가 10-20%일 때 세포성장 및 단백질 농도가 가장 좋았으며 이것은 DO limitation과 비교하여 볼 때 약 20% 향상이 되었으며, IL-2를 생산하는 M5248/pNKM21 균주가 M5248/pBR322, M5248/pAS1 균주보다 외부 유전자의 발현에 의하여 세포성장 및 단백질 생성이 저해되었다. 2. 플라스미드 안정성은 호기적, 혐기적 상태가 DO limitation의 경우보다 그 안정성이 좋았다. 이것은 용존산소가 세포의 생리를 변화시켜 그 안정성이 증가된 것이라고 생각된다. 또한 β-lactamase 활성은 동일한 origin을 갖더라고 외래 유전자의 발현 정도 및 플라스미드 크기가 달라짐에 따라 서로 다른 활성을 보였으며 용존산소 농도의 증가는 β-lactamase 활성을 초래하였다. 3. 재조합 세포의 활성도는 30℃에서 배양시 세포성장 곡선과 마찬가지로 균주에 관계 없이 유사한 경향을 나타내나 42℃로 온도를 전이하면 M5248/pBR322, M5248/pAS1 균주는 정체상태로부터 서서히 생존 세포가 감소하나 IL-2를 생산하는 M5248/pNKM21은 온도 전이후 급격히 떨어지는 현상을 보여 외래 단백질의 발현이 세포내에 stress를 주기 때문일 것이라고 생각된다. 4. IL-2 생산량은 용존산소의 농도가 10-20%일 때 0.33 g/l으로 가장 높았으며 온도 전이시 air stop한 경우는 0.02 g/l로 IL-2 생산이 거의 없는 점으로 보아 용존산소의 농도가 외래 단백질의 발현에 큰 영향을 주는 인자임을 알 수 있다. 5. 고농도 배양시 주요 성장저해 대사산물은 acetic acid 등의 유기산임을 HPLC 분석을 통해 확인할 수 있었고 이들의 발효조내에 15-20 g/l로 축적될 때 세포성장 저해 물질로 작용하며 회분배양에 비교하여 볼 때 DO stat 유가식 배양에서 3.5 배의 균체 농도의 증가를 얻을 수 있었으며, IL-2 생성은 약 3.1배의 증가를 보였다. 또한 acetate 농도를 4.8 g/l 이하로 유지시켜 높은 균체 농도를 얻을 수 있었다.
본 연구는 서로 다른 host/vector system을 갖는 재조합 미생물을 이용하여 재조합 발효인자(세포성장, 단백질 농도, 세포 활성도, 플라스미드 안정성, β-lactamase 활성, IL-2 생성)에 대한 용존산소 농도의 영향을 조사하였으며 고농도 배양을 위하여 DO stat를 이용한 유가식 배양을 하여 IL-2의 생산성을 높이고자 시도하였으며 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 용존 산소 농도가 10-20%일 때 세포성장 및 단백질 농도가 가장 좋았으며 이것은 DO limitation과 비교하여 볼 때 약 20% 향상이 되었으며, IL-2를 생산하는 M5248/pNKM21 균주가 M5248/pBR322, M5248/pAS1 균주보다 외부 유전자의 발현에 의하여 세포성장 및 단백질 생성이 저해되었다. 2. 플라스미드 안정성은 호기적, 혐기적 상태가 DO limitation의 경우보다 그 안정성이 좋았다. 이것은 용존산소가 세포의 생리를 변화시켜 그 안정성이 증가된 것이라고 생각된다. 또한 β-lactamase 활성은 동일한 origin을 갖더라고 외래 유전자의 발현 정도 및 플라스미드 크기가 달라짐에 따라 서로 다른 활성을 보였으며 용존산소 농도의 증가는 β-lactamase 활성을 초래하였다. 3. 재조합 세포의 활성도는 30℃에서 배양시 세포성장 곡선과 마찬가지로 균주에 관계 없이 유사한 경향을 나타내나 42℃로 온도를 전이하면 M5248/pBR322, M5248/pAS1 균주는 정체상태로부터 서서히 생존 세포가 감소하나 IL-2를 생산하는 M5248/pNKM21은 온도 전이후 급격히 떨어지는 현상을 보여 외래 단백질의 발현이 세포내에 stress를 주기 때문일 것이라고 생각된다. 4. IL-2 생산량은 용존산소의 농도가 10-20%일 때 0.33 g/l으로 가장 높았으며 온도 전이시 air stop한 경우는 0.02 g/l로 IL-2 생산이 거의 없는 점으로 보아 용존산소의 농도가 외래 단백질의 발현에 큰 영향을 주는 인자임을 알 수 있다. 5. 고농도 배양시 주요 성장저해 대사산물은 acetic acid 등의 유기산임을 HPLC 분석을 통해 확인할 수 있었고 이들의 발효조내에 15-20 g/l로 축적될 때 세포성장 저해 물질로 작용하며 회분배양에 비교하여 볼 때 DO stat 유가식 배양에서 3.5 배의 균체 농도의 증가를 얻을 수 있었으며, IL-2 생성은 약 3.1배의 증가를 보였다. 또한 acetate 농도를 4.8 g/l 이하로 유지시켜 높은 균체 농도를 얻을 수 있었다.
To optimize the production of interluekin-2(IL-2) by using recombinant Escherichia coli, effects of dissolved oxygen(DO) concentration on the fermentation parameters were investigated with different host/vector system. Recombinant E. coli cells harvoring pBR322, pAS1 and pNKM21 were used, and temper...
To optimize the production of interluekin-2(IL-2) by using recombinant Escherichia coli, effects of dissolved oxygen(DO) concentration on the fermentation parameters were investigated with different host/vector system. Recombinant E. coli cells harvoring pBR322, pAS1 and pNKM21 were used, and temperature was shifted from 30℃ to 42℃ to express the recombinant protein. DO was controlled at a limiting condition and 10-20% saturation level, For a reference, air supply was also stopped at the induction point. Cell growth was most active with DO level of 10-20% saturation and the protein production was also improved significantly. Higher DO level such as 40-50% saturation did not improved the protein production as expected. Plasmid stability was observed to be improved at high DO levels(10-20%), cell viability was observed to be improved by increasing DO level, but the recombinant cells with IL-2 gene, M5248/pNKM21, was not affected by DO level. The volumetric productivity of IL-2 protein was highest at the DO level of 10-20% saturation yielding 0.33 g/l, while air supply was stopped at the induction point, IL-2 production was very low(less than 0.02 g/l). To gain a high density culture of E. coli M5248/pNKM21 in a fed-batch system using the dissoved oxygen as a substrate feed indicator was used. In this study, dissolved oxygen concentration(DOC) was controlled with DO level of 30-60% saturation in a computer control system. Cell growth(OD) and IL-2 production at batch culture were 13 g/l, 0.33 g/l, respectively, resulted in poor growth, lower IL-2 production, however, fed-batch culture under glucose-limiting condition, compare with the batch culture when substrate feeding rate was μ=0.24(feeding pump's flow rate 0.8 bit D/A converter), cell concentration increased to 55.5 g/l, while higher IL-2 production(1.02 g/l) was obstained and relatively lower acetic acid concentration was observed during the cultivation period. Plasmid stability was also improved by fed-batch operation. Further optimization study with fed-batch culture technique was considered therfore necessary to improve the IL-2 production including short-time feeding of glucose at the temperature shift.
To optimize the production of interluekin-2(IL-2) by using recombinant Escherichia coli, effects of dissolved oxygen(DO) concentration on the fermentation parameters were investigated with different host/vector system. Recombinant E. coli cells harvoring pBR322, pAS1 and pNKM21 were used, and temperature was shifted from 30℃ to 42℃ to express the recombinant protein. DO was controlled at a limiting condition and 10-20% saturation level, For a reference, air supply was also stopped at the induction point. Cell growth was most active with DO level of 10-20% saturation and the protein production was also improved significantly. Higher DO level such as 40-50% saturation did not improved the protein production as expected. Plasmid stability was observed to be improved at high DO levels(10-20%), cell viability was observed to be improved by increasing DO level, but the recombinant cells with IL-2 gene, M5248/pNKM21, was not affected by DO level. The volumetric productivity of IL-2 protein was highest at the DO level of 10-20% saturation yielding 0.33 g/l, while air supply was stopped at the induction point, IL-2 production was very low(less than 0.02 g/l). To gain a high density culture of E. coli M5248/pNKM21 in a fed-batch system using the dissoved oxygen as a substrate feed indicator was used. In this study, dissolved oxygen concentration(DOC) was controlled with DO level of 30-60% saturation in a computer control system. Cell growth(OD) and IL-2 production at batch culture were 13 g/l, 0.33 g/l, respectively, resulted in poor growth, lower IL-2 production, however, fed-batch culture under glucose-limiting condition, compare with the batch culture when substrate feeding rate was μ=0.24(feeding pump's flow rate 0.8 bit D/A converter), cell concentration increased to 55.5 g/l, while higher IL-2 production(1.02 g/l) was obstained and relatively lower acetic acid concentration was observed during the cultivation period. Plasmid stability was also improved by fed-batch operation. Further optimization study with fed-batch culture technique was considered therfore necessary to improve the IL-2 production including short-time feeding of glucose at the temperature shift.
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