본 연구는 돼지 복제 수정란의 생산 효율을 높이기 위한 수핵 난자의 확보, 탈핵 효율 증진방안 및 세포 융합 배지의 선별에 관하여 조사하였다. 수핵 난자의 확보를 위한 각종 화학자극물질들의 최적 농도 및 처리시간을 조사한 결과 Ethanol은 10%에서 10분, Ca^++ionophore는 25μM에서 2분, DMAP는 2mM에서 2∼4.5시간, 그리고 Cy...
본 연구는 돼지 복제 수정란의 생산 효율을 높이기 위한 수핵 난자의 확보, 탈핵 효율 증진방안 및 세포 융합 배지의 선별에 관하여 조사하였다. 수핵 난자의 확보를 위한 각종 화학자극물질들의 최적 농도 및 처리시간을 조사한 결과 Ethanol은 10%에서 10분, Ca^++ionophore는 25μM에서 2분, DMAP는 2mM에서 2∼4.5시간, 그리고 Cycloheximide는 5㎍/㎖에서 4∼6시간을 처리하는 것이 돼지 성숙 난자의 활성화에 적합한 것으로 나타났다. 위의 결과들을 토대로 단독, 중복 및 병용처리시의 활성화 효율을 비교하였다. Ca^++ionophore에 있어 DMAP 및 Cycloheximide와의 병용 처리가 다른 처리구에 비해 유의적으로 높았으며(P<0.05), 중복 처리는 단독처리와 별 차이가 없었다. 그러나 Ethanol은 중복처리시 단독처리보다 유의적으로 낮았고(P<0.05), 병용 처리시에는 단독 처리시와 유의적인 차이를 보이지 않았다. 탈핵전 수핵란의 활성화와 활성화하지 않은 수핵란과의 탈핵 효율, 융합율 및 체외 배발달율을 비교한 결과, 탈핵율과 융합율에 있어 탈핵전 활성화 처리구가 각각 90.7%, 71.8%로 무처리구의 77.8%, 61.1%보다 유의적으로 향상된 경향을 나타내었으나(P<0.05), 난할율과 체외 배발달에 있어서는 활성화 처리구가 38.7% 및 19.3%로 활성화하지 않은 처리구 68.8% 및 30.6%보다 유의적으로 저하되었다(P<0.05). 체외 수정란과 미세조작된 복제 수정란의 난할율과 체외 배발달을 비교한 결과, 체외 수정란의 난할율은 85.4%, 상실배까지의 체외 발달율은 65.2%인 반면, 미세조작된 복제수정란의 난할율은 68.8%, 상실배까지의 체외 발달율은 30.6%로 체외 수정란에 비해 유의적(P<0.05)으로 낮은 배발달율을 보였다. 융합배지인 manitol 용액과 DPBS(+)용액의 전기 자극후 활성화율 비교시 manitol 용액이 76.7%로 DPBS 용액 65.7%보다 유의적으로 높았다(P<0.05). 이상의 결과에서 수핵 난자의 확보를 위한 돼지 난자의 활성화는 활성화 자극 물질에 따른 적합한 조건의 확립이 선행되어져야 하며, 탈핵 효율은 탈핵전 활성화로 향상되었으며, 또한 복제 수정란의 최적 세포 융합과 난할 재개를 위한 배지의 선정도 복제 기법의 실용화를 위한 중요한 관건으로 사료된다.
본 연구는 돼지 복제 수정란의 생산 효율을 높이기 위한 수핵 난자의 확보, 탈핵 효율 증진방안 및 세포 융합 배지의 선별에 관하여 조사하였다. 수핵 난자의 확보를 위한 각종 화학자극물질들의 최적 농도 및 처리시간을 조사한 결과 Ethanol은 10%에서 10분, Ca^++ionophore는 25μM에서 2분, DMAP는 2mM에서 2∼4.5시간, 그리고 Cycloheximide는 5㎍/㎖에서 4∼6시간을 처리하는 것이 돼지 성숙 난자의 활성화에 적합한 것으로 나타났다. 위의 결과들을 토대로 단독, 중복 및 병용처리시의 활성화 효율을 비교하였다. Ca^++ionophore에 있어 DMAP 및 Cycloheximide와의 병용 처리가 다른 처리구에 비해 유의적으로 높았으며(P<0.05), 중복 처리는 단독처리와 별 차이가 없었다. 그러나 Ethanol은 중복처리시 단독처리보다 유의적으로 낮았고(P<0.05), 병용 처리시에는 단독 처리시와 유의적인 차이를 보이지 않았다. 탈핵전 수핵란의 활성화와 활성화하지 않은 수핵란과의 탈핵 효율, 융합율 및 체외 배발달율을 비교한 결과, 탈핵율과 융합율에 있어 탈핵전 활성화 처리구가 각각 90.7%, 71.8%로 무처리구의 77.8%, 61.1%보다 유의적으로 향상된 경향을 나타내었으나(P<0.05), 난할율과 체외 배발달에 있어서는 활성화 처리구가 38.7% 및 19.3%로 활성화하지 않은 처리구 68.8% 및 30.6%보다 유의적으로 저하되었다(P<0.05). 체외 수정란과 미세조작된 복제 수정란의 난할율과 체외 배발달을 비교한 결과, 체외 수정란의 난할율은 85.4%, 상실배까지의 체외 발달율은 65.2%인 반면, 미세조작된 복제수정란의 난할율은 68.8%, 상실배까지의 체외 발달율은 30.6%로 체외 수정란에 비해 유의적(P<0.05)으로 낮은 배발달율을 보였다. 융합배지인 manitol 용액과 DPBS(+)용액의 전기 자극후 활성화율 비교시 manitol 용액이 76.7%로 DPBS 용액 65.7%보다 유의적으로 높았다(P<0.05). 이상의 결과에서 수핵 난자의 확보를 위한 돼지 난자의 활성화는 활성화 자극 물질에 따른 적합한 조건의 확립이 선행되어져야 하며, 탈핵 효율은 탈핵전 활성화로 향상되었으며, 또한 복제 수정란의 최적 세포 융합과 난할 재개를 위한 배지의 선정도 복제 기법의 실용화를 위한 중요한 관건으로 사료된다.
This study was carried out to produce of a large quantity recipient oocytes, improve of enucleation efficiency and select of cell fusion medium on practicability of porcine cloned embryos. To determine the optimum concentration and exposure time of ethanol, Ca^++ionophore, DMAP and cycloheximide, in...
This study was carried out to produce of a large quantity recipient oocytes, improve of enucleation efficiency and select of cell fusion medium on practicability of porcine cloned embryos. To determine the optimum concentration and exposure time of ethanol, Ca^++ionophore, DMAP and cycloheximide, in vitro matured oocytes were activated in TCM-199 containing 15% FBS. In optimum concentration and exposure time of various chemicals, ethanol was at 10% for 10min, Ca^++ionophore was at 2 uM for 2min, DMAP was at 2 ㎛ for 2hr ~- 4.5hr and cycloheximide was at 5㎍/mE for 4hr ~ 6hr. On the basis of these results, effect of repeating activation and combination with DMAP or cycloheximide in ethanol or Ca^++ionophore compared with alone activated treatment. Recipient oocytes's activation by Ca^++ionophore combined with DMAP or cycloheximide were significantly higher than alone treatment(P<0.05). Between repeating and alone treatments were not significantly different. In ethanol, repeating treatment was significantly lower than alone(P<0.05), and combination treatments were not significantly different. Efficiency of enucleation , electrical fusion and in vitro development compared preactivated with non-preactivated recipient oocytes. Enucleation and fusion rates of preactivated oocytes were improved significantly compared with non-preactivated oocytes(90.7%, 71.8 vs 77.8%, 61.1%; P<0.05). Behind the back, cleavage and in vitro development rates were significantly lower than non-preactivated oocytes(38.7%, 19.3% vs 68.8%, 30.6%; P<0.05). On the results of in vitro fertilized embryos and cloned embryos were cultured in vitro, cleavage and in vitro developmental rates of cloned embryos were significantly lower than in vitro fertilized embryos( 64.5%, 30.6% vs 85.4%, 65.2%; P<0.05). To select the fusion medium of useful of cloned embryos began cleavage again, investigated the activation effect of manitol and DPBS(+) solution by electric stimulation. Manitol solution was showed 76.7% activation, and was significantly higher than DPBS(+) solution activated 65.7%(P<0.05). These results suggest that activation method of porcine oocytes was established by optimum concentration and exposure time among different chemicals for produce of a large quantity recipient oocytes, and enucleation efficiency was improved by activation before enucleation. Also selection of fusion medium will be important to cell fusion and cleavage begin again on practicability of cloning technique.
This study was carried out to produce of a large quantity recipient oocytes, improve of enucleation efficiency and select of cell fusion medium on practicability of porcine cloned embryos. To determine the optimum concentration and exposure time of ethanol, Ca^++ionophore, DMAP and cycloheximide, in vitro matured oocytes were activated in TCM-199 containing 15% FBS. In optimum concentration and exposure time of various chemicals, ethanol was at 10% for 10min, Ca^++ionophore was at 2 uM for 2min, DMAP was at 2 ㎛ for 2hr ~- 4.5hr and cycloheximide was at 5㎍/mE for 4hr ~ 6hr. On the basis of these results, effect of repeating activation and combination with DMAP or cycloheximide in ethanol or Ca^++ionophore compared with alone activated treatment. Recipient oocytes's activation by Ca^++ionophore combined with DMAP or cycloheximide were significantly higher than alone treatment(P<0.05). Between repeating and alone treatments were not significantly different. In ethanol, repeating treatment was significantly lower than alone(P<0.05), and combination treatments were not significantly different. Efficiency of enucleation , electrical fusion and in vitro development compared preactivated with non-preactivated recipient oocytes. Enucleation and fusion rates of preactivated oocytes were improved significantly compared with non-preactivated oocytes(90.7%, 71.8 vs 77.8%, 61.1%; P<0.05). Behind the back, cleavage and in vitro development rates were significantly lower than non-preactivated oocytes(38.7%, 19.3% vs 68.8%, 30.6%; P<0.05). On the results of in vitro fertilized embryos and cloned embryos were cultured in vitro, cleavage and in vitro developmental rates of cloned embryos were significantly lower than in vitro fertilized embryos( 64.5%, 30.6% vs 85.4%, 65.2%; P<0.05). To select the fusion medium of useful of cloned embryos began cleavage again, investigated the activation effect of manitol and DPBS(+) solution by electric stimulation. Manitol solution was showed 76.7% activation, and was significantly higher than DPBS(+) solution activated 65.7%(P<0.05). These results suggest that activation method of porcine oocytes was established by optimum concentration and exposure time among different chemicals for produce of a large quantity recipient oocytes, and enucleation efficiency was improved by activation before enucleation. Also selection of fusion medium will be important to cell fusion and cleavage begin again on practicability of cloning technique.
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