L. reuteri genomic DNA를 BamHI, EcoRI, HindIII, PstI 제한효소로 절단한 후 pUC19과 결합시켜 총 EcoRI 467, HindIII 417, PstI 172, BamHI 91 개로 구성된 library를 얻었다. 첫 번째 Linoleate isomerase로 추정되는 단백질의 N-말단 아미노산 서열 (LPPNGKKVLM)을 기초로 하여 degenerate primer LI-1(TDCCWCCWAAYGGYAARAARGTHYTDATG)을 디자인하였으며 이를 probe로 사용하여 library를 탐색한 결과 188 kb EcoRI 조각이 클로닝 된 재조합 plamisd를 얻어 pNE347이라 명명하였다. 1.88 kb의 DNA ...
L. reuteri genomic DNA를 BamHI, EcoRI, HindIII, PstI 제한효소로 절단한 후 pUC19과 결합시켜 총 EcoRI 467, HindIII 417, PstI 172, BamHI 91 개로 구성된 library를 얻었다. 첫 번째 Linoleate isomerase로 추정되는 단백질의 N-말단 아미노산 서열 (LPPNGKKVLM)을 기초로 하여 degenerate primer LI-1(TDCCWCCWAAYGGYAARAARGTHYTDATG)을 디자인하였으며 이를 probe로 사용하여 library를 탐색한 결과 188 kb EcoRI 조각이 클로닝 된 재조합 plamisd를 얻어 pNE347이라 명명하였다. 1.88 kb의 DNA 염기서열 (Accession number: AF140482)을 결정한 결과 pyrH 외에도 tsf (elongation factor-Ts), frr (ribosomal recycling factor) 유전자들도 확인하였다. pyrH는 723 bp 로서 UMP-kinase는 241개의 아미노산으로 이루어진 분자량 25,957 Da 크기의 단백질임을 확인하였다. 그리고 L. lacits subsp. lactis IL1403 (AE006430), L. lactis subsp. cremoris MG1363 (AJ011960) 등의 UMP kinase 아미노산 서열과 상동성은 각각 72%, 68%로 높게 나타났다. Lb. reuteri에서 pyrimidine 염기생성에 관여하는 유전자들은 다른 그람양성균들에서 알려진 것 같이 하나의 operon (tsf-pyrH-frr)으로 구성되어 있는 것으로 추측된다. 두 번째 Linoleate isomerase로 추정되는 단백질의 N-말단 아미노산 서열 (MYKFRLPEMGEGLTE)를 BlastP2로 조사한 결과 lipoamide acyltransferase와 유사한 것으로 나타났다. 이를 기초로하여 degenerate primer LI-2 (TAYAARTTYCGKYTDCCWGARATGGGYGARGG)를 디자인하였으며 이를 이용한 library 탐색 결과 2.232 kb EcoRI 조각이 클로닝된 pNE133, pNE258을 얻었다. 이들 클론들의 DNA 염기서열을 확인한 결과 pyruvate dehydrogenase (PDH) complex를 형성하는 효소들 중 하나인 pdhC (Dihydrolipoyl acetyltransferase, E2 subunit, 48 kDa) 유전자를 확인하였고 pdhC 주위에 pdhB (Pyruvate dehydrogenase, E1β, 36 kDa), pdhA (Pyruvate dehydrogenase, E1α, 41 kDa) 유전자들도 확인하였다. 이들 유전자들의 아미노산 서열을 Blast program으로 data library의 단백질들과 비교한 결과 Bacillus stearothemophilus, Bacillus halodurans, Bacillus subtilis,. Lactococcus lactis subsp. lactis 등의 PDH 효소들과 유사도가 높게 나타났다. 결론적으로 pyrH, pdhC 유전자들은 L. reuteri에서 중요한 에너지 및 물질대사 경로에 관여하는 효소 단백질들의 유전자로서 L. reuteri의 유전적 연구에 기초자료로서 가치가 클 것으로 생각된다.
L. reuteri genomic DNA를 BamHI, EcoRI, HindIII, PstI 제한효소로 절단한 후 pUC19과 결합시켜 총 EcoRI 467, HindIII 417, PstI 172, BamHI 91 개로 구성된 library를 얻었다. 첫 번째 Linoleate isomerase로 추정되는 단백질의 N-말단 아미노산 서열 (LPPNGKKVLM)을 기초로 하여 degenerate primer LI-1(TDCCWCCWAAYGGYAARAARGTHYTDATG)을 디자인하였으며 이를 probe로 사용하여 library를 탐색한 결과 188 kb EcoRI 조각이 클로닝 된 재조합 plamisd를 얻어 pNE347이라 명명하였다. 1.88 kb의 DNA 염기서열 (Accession number: AF140482)을 결정한 결과 pyrH 외에도 tsf (elongation factor-Ts), frr (ribosomal recycling factor) 유전자들도 확인하였다. pyrH는 723 bp 로서 UMP-kinase는 241개의 아미노산으로 이루어진 분자량 25,957 Da 크기의 단백질임을 확인하였다. 그리고 L. lacits subsp. lactis IL1403 (AE006430), L. lactis subsp. cremoris MG1363 (AJ011960) 등의 UMP kinase 아미노산 서열과 상동성은 각각 72%, 68%로 높게 나타났다. Lb. reuteri에서 pyrimidine 염기생성에 관여하는 유전자들은 다른 그람양성균들에서 알려진 것 같이 하나의 operon (tsf-pyrH-frr)으로 구성되어 있는 것으로 추측된다. 두 번째 Linoleate isomerase로 추정되는 단백질의 N-말단 아미노산 서열 (MYKFRLPEMGEGLTE)를 BlastP2로 조사한 결과 lipoamide acyltransferase와 유사한 것으로 나타났다. 이를 기초로하여 degenerate primer LI-2 (TAYAARTTYCGKYTDCCWGARATGGGYGARGG)를 디자인하였으며 이를 이용한 library 탐색 결과 2.232 kb EcoRI 조각이 클로닝된 pNE133, pNE258을 얻었다. 이들 클론들의 DNA 염기서열을 확인한 결과 pyruvate dehydrogenase (PDH) complex를 형성하는 효소들 중 하나인 pdhC (Dihydrolipoyl acetyltransferase, E2 subunit, 48 kDa) 유전자를 확인하였고 pdhC 주위에 pdhB (Pyruvate dehydrogenase, E1β, 36 kDa), pdhA (Pyruvate dehydrogenase, E1α, 41 kDa) 유전자들도 확인하였다. 이들 유전자들의 아미노산 서열을 Blast program으로 data library의 단백질들과 비교한 결과 Bacillus stearothemophilus, Bacillus halodurans, Bacillus subtilis,. Lactococcus lactis subsp. lactis 등의 PDH 효소들과 유사도가 높게 나타났다. 결론적으로 pyrH, pdhC 유전자들은 L. reuteri에서 중요한 에너지 및 물질대사 경로에 관여하는 효소 단백질들의 유전자로서 L. reuteri의 유전적 연구에 기초자료로서 가치가 클 것으로 생각된다.
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