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Capillary와 Nano LC/ESI-MS/MS 질량분석법을 이용한 화합물의 구조분석은 분리와 분석을 동시에 수행함은 물론 높은 분해능과 감도를 보여줌으로써 미량의 혼합시료 분석에 매우 중요한 도구로 자리잡고 있다. 본 연구에서는 이 분석법을 최근 가장 크게 주목을 받는 단백질과 의약품분석 분야에 적용하여 새로운 분석방법을 개발하고 그 가능성을 평가 하고자 하였다. 단백질 분석에서는 첫째, 전사후수식화(post-translational modification)된 단백질을 분석하기 위한 방법의 연구로 ...

Capillary와 Nano LC/ESI-MS/MS 질량분석법을 이용한 화합물의 구조분석은 분리와 분석을 동시에 수행함은 물론 높은 분해능과 감도를 보여줌으로써 미량의 혼합시료 분석에 매우 중요한 도구로 자리잡고 있다. 본 연구에서는 이 분석법을 최근 가장 크게 주목을 받는 단백질과 의약품분석 분야에 적용하여 새로운 분석방법을 개발하고 그 가능성을 평가 하고자 하였다. 단백질 분석에서는 첫째, 전사후수식화(post-translational modification)된 단백질을 분석하기 위한 방법의 연구로 아세틸화 되어 있는 단백질을 Capillary와 Nano-LC/ESI/TOF-MS를 이용하여 분석하였다. 단백질을 가수분해 한 후 생성되는 펩타이드 혼합물로부터 수식화된 펩타이드만을 선택적으로 확인하기 위해 수식화 관련 특정 분해이온을 검출하는 방법을 적용하였고, 기존에 알려져 있던 이온보다 더 감도가 좋고 선택적인 m/z 126.1의 새 표시이온으로 아세틸화 lysine을 포함하는 펩타이드를 쉽게 확인할 수 있었다. 이 이온으로 확인된 펩타이드들은 그들의 MS/MS 스펙트럼으로부터 아미노산 서열과 아세틸 lysine의 위치를 정확히 알 수 있었다. 이 방법을 human HeLa cell에서 추출된 H4 단백질의 아세틸화를 확인하는데 적용하여 TSA로 유도된 아세틸화를 확인하였다. 둘째로, 대량의 단백질을 빠른 시간 안에 확인하는 프로테옴분석을 위해 이차원 액체크로마토그래피(2D LC)와 Nano-LC/ESI/QTOF-MS 질량분석기를 on-line으로 연결한 프로테옴분석 시스템을 구성하고 표준 단백질 시료인 cytochrome C로 평가하였다. 모세관 양이온교환수지 칼럼, μ-precolumn 그리고 Nano-C18 칼럼을 six port valve 2개를 이용하여 연결하고 Nano-ESI/QTOF-MS 질량분석기와 on-line으로 연결하였다. Cytochrome C의 가수분해 생성물인 펩타이드시료들은 모세관 양이온교환수지 칼럼에서 분획되고 on-line desalting 후 Nano-C18 칼럼에서 분리되었다. 분리된 펩타이드 시료에서 mass dependent MS/MS 방법으로 분해이온 질량스펙트럼을 얻었으며 이 결과를 단백질 확인용 database search 프로그램으로 검색한 결과 정확히 일치하는 결과를 얻을 수 있었다. 셋째로 의약품 분석에서는 Capillary-LC/ESI/MS를 이용하여 cephalosporin 계열의 항생제인 ceftiofur와 cefotaxime을 분석하였으며, 미량으로 혼합되어 있는 불순물의 구조를 질량스펙트럼을 통해 확인하고 불순물의 형태를 비교하였다. 각각의 화합물에 대해 β-Lactam 고리의 분해와 아민기, 아세틸기, 카르복시기, 메톡시기 등의 추가적 작용기 이탈에 의한 특정 피크를 관찰함으로써 구조 변화를 확인할 수 있었다. Ceftiofur의 경우 제조과정 중 부가적 반응으로 생긴 불순물들이 많이 확인되었으며, β-Lactam 고리의 분해가 쉽게 일어났고 C3 치환체는 비교적 안정적이었다. Cefotaxime은 ceftiofur와 달리 β-Lactam의 분해에 의한 생성물보다는 C3 치환체인 side chain의 변형과 분해에 의한 생성물들이 주로 관찰되었다. 이상의 결과에서 미량이면서 혼합물 상태로 존재하여 그 동안 분석이 어려웠던 시료에 대해 Capillary와 Nano-LC/ESI-MS/MS 질량분석법을 이용한 구조분석법으로 새로운 방향을 제시할 수 있었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Recently, Capillary and Nano-LC/ESI-MS/MS has been became an important tool for the analysis of the trace mixture due to their high sensitivity and resolution when sample amounts were limited as well as separation and identification at the same time. In this study, the analytical technique was appli...

Recently, Capillary and Nano-LC/ESI-MS/MS has been became an important tool for the analysis of the trace mixture due to their high sensitivity and resolution when sample amounts were limited as well as separation and identification at the same time. In this study, the analytical technique was applied to protein and drug analysis showing great interests and new analytical methods were developed and evaluated. First, I described a method for identifying protein acetylation at lysine residues as one of post translationally modification by analysis of digested protein using Capillary-LC/ESI/TOF-MS with a new modification-specific marker ion. We have found a novel marker ion at m/z 126.1, which is a further fragment ion induced by the loss of NH_(3) from the acetylated lysine immonium ions at m/z 143.1. This novel marker ion was found to be more specific and approximately nine times more sensitive than the immonium ion at m/z 143.1. In addition, no interfering ions for acetylated peptides were found in the extracted ion chromatogram at m/z 126.1. The utility of this method was demonstrated with acetylated cytochrome C as a model compound. After the modification was probed by the new marker ion, the acetylated lysine site was determined by the MS/MS spectrum. This method was applied to identify histone H4 acetylation in HeLa cells treated with trichostatin A. Three protein bands separated by acid-urea-triton gel electrophoresis were confirmed as tetra, tri and di-acetylated histone H4 at lysines 5, 8, 12 and 16. This method may be useful for assaying for lysine acetylation, which is an important regulatory process for a range of biological functions. Second, a comprehensive two-dimensional liquid chromatography (2D-LC) and Nano-LC/ESI/QTOF-MS/MS system for the high throughput proteome analysis was established. This system separates the enzymatically digested peptides with cation-exchange chromatography, followed by reversed phase chromatography. The two LC systems were coupled by two six port valves. A digested peptides mixture of cytochrome C is loaded onto a capillary column packed with strong cation exchange (SCX) materials. First, peptides are sequentially fractionated from the SCX phase into the RP precolumn, where concentration and desalting are occurred. Next, peptides are separated on Nano-LC C18 column and identified directly by a ESI/QTOF mass spectrometer in mass dependent MS/MS data acquire mode. Protein identities are determined by correlating the tandem mass spectra of mass-fragmented peptides to protein sequencing mass-database. In this way, a complex protein mixture of proteome from biological origin can be on-line separated and identified. Third, Capillary-LC/ESI-MS/MS method was applied for the identification of trace impurities in cephalosporin antibiotics. In drug analysis, it has been very important to identify and quantify impurities in drug samples to control drug quality and prevent unexpected effects by impurities. Several impurities were separated on Micro-C18 column and I could identify their structures from MS/MS spectra by collision-induced dissociation. Cephalosporins showed various characteristic fragment ions by β-Lactam and sulfur ring cleavage and loss of functional group. Impurities in bulk ceftiofur were confirmed as degraded products by β-Lactam ring cleavage and over reaction arising from the manufacturing process. In the case of cefotaxime, degraded products by decomposition of side chain were mainly found. Also, the pattern of impurities showed in two cephalosporin antibiotics was examined.

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