Nitric Oxide (NO)는 생체에서 발생하는 가스성 물질로 반응성이 매우 강하며 동맥이나 혈관의 이완작용, 신경계에서 신호전달 물질, 혈소판의 응집이나 염증세포가 혈관의 내피세포에 부착되는 것을 억제하는 작용을 한다고 알려졌다. NO는 NO synthase (NOS)라는 유도성 혹은 상존성 효소에 의하여 생성되어지는데 이렇게 생성된 NO는 숙주내에 침입한 미생물이나 암세포를 살해하는데 가장 강력한 세포 독성물질로 작용하여 생체반응에 있어서 효과분자로써의 역할을 한다. 또한 NO는 자신의 세포나 조직을 공격하여 발생하는 뇌척수염, 류마토이드성 관절염, 포도막염같은 염증성 질환이나 ...
Nitric Oxide (NO)는 생체에서 발생하는 가스성 물질로 반응성이 매우 강하며 동맥이나 혈관의 이완작용, 신경계에서 신호전달 물질, 혈소판의 응집이나 염증세포가 혈관의 내피세포에 부착되는 것을 억제하는 작용을 한다고 알려졌다. NO는 NO synthase (NOS)라는 유도성 혹은 상존성 효소에 의하여 생성되어지는데 이렇게 생성된 NO는 숙주내에 침입한 미생물이나 암세포를 살해하는데 가장 강력한 세포 독성물질로 작용하여 생체반응에 있어서 효과분자로써의 역할을 한다. 또한 NO는 자신의 세포나 조직을 공격하여 발생하는 뇌척수염, 류마토이드성 관절염, 포도막염같은 염증성 질환이나 자가면역 질환을 매개하여 조직의 손상을 유발하는 물질임이 이미 보고되었다. 따라서 본 논문에서는 면역계에서 NO의 기능을 크게 두가지 관점에서 연구하고자 하였다. 첫째, 효과분자로서의 NO의 기능이다. 자가면역질환의 하나인 사람의 무정자증의 동물 모델인 experimental allergic orchitis (EAO)에서 NO의 역할은 규명되어있지 않았기 때문에 EAO에서 NO가 조직손상의 원인물질 즉 효과분자로서의 기능을 규명하고자 하였다. 둘째, 지금까지 면역효과분자로서의 NO는 많이 연구가 되어있지만 면역반응 조절분자로서의 기능에 관한 연구는 많이 되어있지 않다. 따라서 면역조절분자로서의 NO의 기능을 연구하고자 하였다. 고환내의 염증질환인 EAO를 유발하기 위하여 정상 기니아피그의 고환에서 crude extract (CE)와 glycoprotein 1 (GP1)을 분리하여 자가항원으로 사용하였다. 즉 분리한 자가항원인 CE와 GP1 각각 20㎍을 기니아피그의 발바닥에 1차 면역한 후 8일 후에 동일 항원의 동일 양으로 2차 면역하였다. 2차 면역한 후 17일 후에 EAO 발생여부를 확인하기 위하여 고환을 적출하여 조직학적인 방법으로 염증 여부를 조사하였다. CE와 GP1을 주사한 고환에서는 intertuble내에 많은 수의 염증세포의 침윤이 이루어졌으며 seminiferous tublc 내는 정자형성과정이 완전히 저해되는 등 저명한 EAO 발생을 확인할 수 있었다. 한편 EAO 발생시에 NO가 관여하는지를 확인하고자 iNOS에 대한 RT-PCR, Northern blot 또는 면역조직화학염색등의 방법을 이용한 결과 자가항원을 주사한 고환에서 정상 고환과 비교하였을 경우 현저한 iNOS mRNA 발현과 iNOS 단백질이 검출되었다. 또한 NO와 superoxide로부터 생성되는 강력한 산화제로서 조직의 손상을 야기하는 peroxynitrite생성을 확인하기 위하여 nitrotyrosine에 대한 면역조직화학염색을 시행한 결과 항원을 주사한 고환에서 역시 생성되어 NO와 항께 조직손상을 매개함을 알 수 있었다. 또한 iNOS와 nitotyrosine은 침윤된 대식세포에서 생성됨을 대식세포의 표지자인 Mac-1 면역조직화학염색을 통하여 규명할 수 있었다. 과연 NO가 EAO 발생 시 생성되어 조직 손상의 중요한 분자인지를 확인하기 위하여 NO 생성을 저해할 경우 EAO의 발생이 저해되는지를 iNOS의 선택적인 저해제인 amioguanidine (AG)를 사용하여보았다. AG를 농도의존적으로 사용하였을 경우 염증반응은 물론 iNOS 생성, 대식세포의 동원 그리고 peroxynitrite의 생성이 현저히 줄어듬을 확인하였고 이는 NO가 EAO 발생에 직접적인 효과분자로서 작용함을 의미한다. No는 시험관내에서 비장세포의 분열 및 증식을 억제하고 interleukin-2(IL-2)나 interleukin-8(IL-8)의 분비를 억제하여 interferon-γ(IFN-γ)의 생성을 억제한다고 보고되었다. 즉, NO는 Th1 cytokine인 (IFN-γ)에 의해 주로 대식세포에서 생성되어 면역효과분자로서의 역할을 하기도하지만 이미 분비된 IFN-γ에 의해 다량으로 생성된 NO나 또는 NO donor인 molsidomine (MSDM)을 이용하였을 경우 면역반응을 Th1에서 Th2 반응으로 전환함으로서 Th1 매개성 자가면역질환을 항원 특이적으로 Th2 세포에 의한 면역반응으로 전환할 수 있는 면역조절분자로서의 역할을 수행하는지 규명하고자하였다. Th1 매개성 자가면역질환인 experimental allergic uveoretinitis (EAU)와 experimental allergic encephalomyelitis (EAE)를 유발하기위하여 자가항원인 interphotoreceptor retinoid binding protein (IRBP)와 myelin basic protein (MBP)을 각각 Lewis rat에 주사하였다. EAU는 100㎍ IRBP를 면역한 후 9일째부터 발생하였고 12일째 grade 3.5까지의 심한 상태를 보였으며 15일째부터 서서히 감소하기 시작하였다. 200㎍의 MBP 면역에 의하여 EAE는 18일째부터 발생 14일째 최고치에 달하였으며 15일째부터 감소하기 시작하였다. IRBP 면역과 함께 MSDM을 경구투여한 랫트에서는 평균 grade 1의 현저히 감소된 상태의 EAU발생을 확인할 수 있었다. EAE의 경우 MSDM을 초기단계 (day-1~4), 후기단계 (day7~10) 그리고 계속하여 투여(day-1~15)한 군으로 나뉘어 투여하였다. 이때 초기에 투여한 랫트와 계속하여 투여한 랫트에서는 현저히 EAE의 발생이 억제 되었지만 후기 단계에 투여한 랫트는 억제효과가 거의 없음을 확인하였다. ELISA 방법에 의하여 cytokine분비를 측정하기 위하여 lymphnode를 적출하여 lymphocyte를 배양하여 Th1 cytokine인 IFN-γ와 Th2 cytokine인 interleukin-10 (IL-10)을 측정한 결과 IRBP와 MBP에 의하여 EAU와 EAE가 심하게 발생한 경우 IFN-γ의 생성이 현저하였으며 IL-10은 거의 생성되지 않았고 이때 MSDM을 투여하여 EAU가 저해된 lymphocyte에서는 적은양의 IFN-γ와 현저히 많은 양의 IL-10이 생성됨을 확인할 수 있었다. 또한 MSDM을 초기와 계속하여 투여한 랫트에서도 역시 증가된 IL-10 생성과 감소된 IFN-γ의 생성정도를 알 수 있었다. 이는 Th1 매개성 자가면역질환의 저해효과가 NO가 면역반응을 Th1에서 Th2 반응으로 전환함에 의하여 이루어짐을 의미한다. 본 연구의 결론을 종합하여보면 면역계에서 NO는 조직의 손상을 야기하는 면역효과분자로서 작용하기도 하지만 cytokine의 분비를 조절하여 면역반응의 전환을 유도하는 면역조절분자로서의 역할을 하기도하며 이는 NO donor를 이 용하였을 경우 Th1 면역반응을 Th2 면역반응으로 전환을 유도하여 NO 매개 성 Th1 자가면역질환의 치료적 기전을 규명할 수 있는 연구자료로 사료된다.
Nitric Oxide (NO)는 생체에서 발생하는 가스성 물질로 반응성이 매우 강하며 동맥이나 혈관의 이완작용, 신경계에서 신호전달 물질, 혈소판의 응집이나 염증세포가 혈관의 내피세포에 부착되는 것을 억제하는 작용을 한다고 알려졌다. NO는 NO synthase (NOS)라는 유도성 혹은 상존성 효소에 의하여 생성되어지는데 이렇게 생성된 NO는 숙주내에 침입한 미생물이나 암세포를 살해하는데 가장 강력한 세포 독성물질로 작용하여 생체반응에 있어서 효과분자로써의 역할을 한다. 또한 NO는 자신의 세포나 조직을 공격하여 발생하는 뇌척수염, 류마토이드성 관절염, 포도막염같은 염증성 질환이나 자가면역 질환을 매개하여 조직의 손상을 유발하는 물질임이 이미 보고되었다. 따라서 본 논문에서는 면역계에서 NO의 기능을 크게 두가지 관점에서 연구하고자 하였다. 첫째, 효과분자로서의 NO의 기능이다. 자가면역질환의 하나인 사람의 무정자증의 동물 모델인 experimental allergic orchitis (EAO)에서 NO의 역할은 규명되어있지 않았기 때문에 EAO에서 NO가 조직손상의 원인물질 즉 효과분자로서의 기능을 규명하고자 하였다. 둘째, 지금까지 면역효과분자로서의 NO는 많이 연구가 되어있지만 면역반응 조절분자로서의 기능에 관한 연구는 많이 되어있지 않다. 따라서 면역조절분자로서의 NO의 기능을 연구하고자 하였다. 고환내의 염증질환인 EAO를 유발하기 위하여 정상 기니아피그의 고환에서 crude extract (CE)와 glycoprotein 1 (GP1)을 분리하여 자가항원으로 사용하였다. 즉 분리한 자가항원인 CE와 GP1 각각 20㎍을 기니아피그의 발바닥에 1차 면역한 후 8일 후에 동일 항원의 동일 양으로 2차 면역하였다. 2차 면역한 후 17일 후에 EAO 발생여부를 확인하기 위하여 고환을 적출하여 조직학적인 방법으로 염증 여부를 조사하였다. CE와 GP1을 주사한 고환에서는 intertuble내에 많은 수의 염증세포의 침윤이 이루어졌으며 seminiferous tublc 내는 정자형성과정이 완전히 저해되는 등 저명한 EAO 발생을 확인할 수 있었다. 한편 EAO 발생시에 NO가 관여하는지를 확인하고자 iNOS에 대한 RT-PCR, Northern blot 또는 면역조직화학염색등의 방법을 이용한 결과 자가항원을 주사한 고환에서 정상 고환과 비교하였을 경우 현저한 iNOS mRNA 발현과 iNOS 단백질이 검출되었다. 또한 NO와 superoxide로부터 생성되는 강력한 산화제로서 조직의 손상을 야기하는 peroxynitrite생성을 확인하기 위하여 nitrotyrosine에 대한 면역조직화학염색을 시행한 결과 항원을 주사한 고환에서 역시 생성되어 NO와 항께 조직손상을 매개함을 알 수 있었다. 또한 iNOS와 nitotyrosine은 침윤된 대식세포에서 생성됨을 대식세포의 표지자인 Mac-1 면역조직화학염색을 통하여 규명할 수 있었다. 과연 NO가 EAO 발생 시 생성되어 조직 손상의 중요한 분자인지를 확인하기 위하여 NO 생성을 저해할 경우 EAO의 발생이 저해되는지를 iNOS의 선택적인 저해제인 amioguanidine (AG)를 사용하여보았다. AG를 농도의존적으로 사용하였을 경우 염증반응은 물론 iNOS 생성, 대식세포의 동원 그리고 peroxynitrite의 생성이 현저히 줄어듬을 확인하였고 이는 NO가 EAO 발생에 직접적인 효과분자로서 작용함을 의미한다. No는 시험관내에서 비장세포의 분열 및 증식을 억제하고 interleukin-2(IL-2)나 interleukin-8(IL-8)의 분비를 억제하여 interferon-γ(IFN-γ)의 생성을 억제한다고 보고되었다. 즉, NO는 Th1 cytokine인 (IFN-γ)에 의해 주로 대식세포에서 생성되어 면역효과분자로서의 역할을 하기도하지만 이미 분비된 IFN-γ에 의해 다량으로 생성된 NO나 또는 NO donor인 molsidomine (MSDM)을 이용하였을 경우 면역반응을 Th1에서 Th2 반응으로 전환함으로서 Th1 매개성 자가면역질환을 항원 특이적으로 Th2 세포에 의한 면역반응으로 전환할 수 있는 면역조절분자로서의 역할을 수행하는지 규명하고자하였다. Th1 매개성 자가면역질환인 experimental allergic uveoretinitis (EAU)와 experimental allergic encephalomyelitis (EAE)를 유발하기위하여 자가항원인 interphotoreceptor retinoid binding protein (IRBP)와 myelin basic protein (MBP)을 각각 Lewis rat에 주사하였다. EAU는 100㎍ IRBP를 면역한 후 9일째부터 발생하였고 12일째 grade 3.5까지의 심한 상태를 보였으며 15일째부터 서서히 감소하기 시작하였다. 200㎍의 MBP 면역에 의하여 EAE는 18일째부터 발생 14일째 최고치에 달하였으며 15일째부터 감소하기 시작하였다. IRBP 면역과 함께 MSDM을 경구투여한 랫트에서는 평균 grade 1의 현저히 감소된 상태의 EAU발생을 확인할 수 있었다. EAE의 경우 MSDM을 초기단계 (day-1~4), 후기단계 (day7~10) 그리고 계속하여 투여(day-1~15)한 군으로 나뉘어 투여하였다. 이때 초기에 투여한 랫트와 계속하여 투여한 랫트에서는 현저히 EAE의 발생이 억제 되었지만 후기 단계에 투여한 랫트는 억제효과가 거의 없음을 확인하였다. ELISA 방법에 의하여 cytokine분비를 측정하기 위하여 lymphnode를 적출하여 lymphocyte를 배양하여 Th1 cytokine인 IFN-γ와 Th2 cytokine인 interleukin-10 (IL-10)을 측정한 결과 IRBP와 MBP에 의하여 EAU와 EAE가 심하게 발생한 경우 IFN-γ의 생성이 현저하였으며 IL-10은 거의 생성되지 않았고 이때 MSDM을 투여하여 EAU가 저해된 lymphocyte에서는 적은양의 IFN-γ와 현저히 많은 양의 IL-10이 생성됨을 확인할 수 있었다. 또한 MSDM을 초기와 계속하여 투여한 랫트에서도 역시 증가된 IL-10 생성과 감소된 IFN-γ의 생성정도를 알 수 있었다. 이는 Th1 매개성 자가면역질환의 저해효과가 NO가 면역반응을 Th1에서 Th2 반응으로 전환함에 의하여 이루어짐을 의미한다. 본 연구의 결론을 종합하여보면 면역계에서 NO는 조직의 손상을 야기하는 면역효과분자로서 작용하기도 하지만 cytokine의 분비를 조절하여 면역반응의 전환을 유도하는 면역조절분자로서의 역할을 하기도하며 이는 NO donor를 이 용하였을 경우 Th1 면역반응을 Th2 면역반응으로 전환을 유도하여 NO 매개 성 Th1 자가면역질환의 치료적 기전을 규명할 수 있는 연구자료로 사료된다.
Nitric Oxide (NO) has been shown to act as a potent cytotoxic effector molecule in immune defense. NO conveys protection against many intracellular bacteria, parasites and viral infection. NO-dependent tissue destruction and disease has been seen in several autoimmunity models, such as experimental ...
Nitric Oxide (NO) has been shown to act as a potent cytotoxic effector molecule in immune defense. NO conveys protection against many intracellular bacteria, parasites and viral infection. NO-dependent tissue destruction and disease has been seen in several autoimmunity models, such as experimental allergic encephalomyelitis (EAE} and experimental allergic uveoretinitis (EAU). Zn these studies, I investigated possible role of NO in experimental allergic orchitis (EAO), a model of testicular inflammation, induced in the guinea pig following two footpads injection of testicular antigens, crude extract (CE) and glycoprotein 1 (GP1), isolated from normal guinea pig testes. Inflammation was not induced in normal guinea pig testis, but strongly induced in CE- or GP1-treated testes. Inducible nitric oxide synthase (iNOS) and nitrotyrosine were detected by infiltrating macrophages during the inflammatory stages of EAO, whereas testes from untreated animal were not detected. Zntraperitoneal administration of aminoguanidine, a non specific NOS inhibitor, to immunized animals reduced inflammation, iNOS expression and peroxynitrite formation, dose dependently. These results suggest that NO is a pivotal cytotoxic effector molecule in the pathogenesis of EAO and the importance of the macrophage as an effector cell in what is considered a CD4+T cell-dependent disease. Autoimmune disease in animals are delayed or suppressed by the administration of NOS inhibitor. However, contrary evidence is now appearing that despite its demonstrated role in certain tissue pathology. In vivo inhibition of iNOS not only exacerbates EAE but also converts to highly susceptible. Furthermore, NO knockout mice showed only minor suppression of autoimmune disease. These findings now lead me to conclude that NO appears to be as an important immunoregulator in autoimmune disease as it is a cytotoxic effector molecule. Pathogenic effector T cells in EAU and EAE are Th1 cells, which produce interleukin-2(IL-2) and interferon-γ(IFN-γ). EAE and EAU are well known to be associated with predisposition to a Th1-dominated (IFN-γ high, IL-4 low) instead of a Th2-dominated (IFN-γ low, IL-4 high) response. Therefore, here, I expected that administration of NO would have disease reducing effects as an immunoregulatory molecule by switching Th1 to Th2 immune response in EAU and EAE models. Lewis rats were immunized with interphotoreceptor retinoid binding protein (IRBP) and myelin basic protein (MBP) to induce EAU and EAE, respectively, with or without oral administration of NO. Administration of molsidomine (MSDM} (10 mg/kg/day), a NO donor, significantly prevented the clinical development of EAU and EAE with a reduction in ocular and spinal cord inflammation. High levels of IL-10, Th2 cytokine, was detected in the cultured lymphocytes, whereas IFN-γ, Th1 cytokine, was down regulated. hand, antigen-immunized rats without molsidomine administration showed severe disease development and secreted higher amounts of IFN- p than molsidomine administered rats, but secreted small amount of IL-10. By above data, it can be said that NO switched the Th1 response toward the Th2 response. These results indicated that NO in immune system comprises both effector(tissue destruction) and regulatory functions (modulation of cytokine response). In conclusion, we revealed for the first time that administration of NO suppresses autoimmune disease by regulating the Th1/Th2 balance.
Nitric Oxide (NO) has been shown to act as a potent cytotoxic effector molecule in immune defense. NO conveys protection against many intracellular bacteria, parasites and viral infection. NO-dependent tissue destruction and disease has been seen in several autoimmunity models, such as experimental allergic encephalomyelitis (EAE} and experimental allergic uveoretinitis (EAU). Zn these studies, I investigated possible role of NO in experimental allergic orchitis (EAO), a model of testicular inflammation, induced in the guinea pig following two footpads injection of testicular antigens, crude extract (CE) and glycoprotein 1 (GP1), isolated from normal guinea pig testes. Inflammation was not induced in normal guinea pig testis, but strongly induced in CE- or GP1-treated testes. Inducible nitric oxide synthase (iNOS) and nitrotyrosine were detected by infiltrating macrophages during the inflammatory stages of EAO, whereas testes from untreated animal were not detected. Zntraperitoneal administration of aminoguanidine, a non specific NOS inhibitor, to immunized animals reduced inflammation, iNOS expression and peroxynitrite formation, dose dependently. These results suggest that NO is a pivotal cytotoxic effector molecule in the pathogenesis of EAO and the importance of the macrophage as an effector cell in what is considered a CD4+T cell-dependent disease. Autoimmune disease in animals are delayed or suppressed by the administration of NOS inhibitor. However, contrary evidence is now appearing that despite its demonstrated role in certain tissue pathology. In vivo inhibition of iNOS not only exacerbates EAE but also converts to highly susceptible. Furthermore, NO knockout mice showed only minor suppression of autoimmune disease. These findings now lead me to conclude that NO appears to be as an important immunoregulator in autoimmune disease as it is a cytotoxic effector molecule. Pathogenic effector T cells in EAU and EAE are Th1 cells, which produce interleukin-2(IL-2) and interferon-γ(IFN-γ). EAE and EAU are well known to be associated with predisposition to a Th1-dominated (IFN-γ high, IL-4 low) instead of a Th2-dominated (IFN-γ low, IL-4 high) response. Therefore, here, I expected that administration of NO would have disease reducing effects as an immunoregulatory molecule by switching Th1 to Th2 immune response in EAU and EAE models. Lewis rats were immunized with interphotoreceptor retinoid binding protein (IRBP) and myelin basic protein (MBP) to induce EAU and EAE, respectively, with or without oral administration of NO. Administration of molsidomine (MSDM} (10 mg/kg/day), a NO donor, significantly prevented the clinical development of EAU and EAE with a reduction in ocular and spinal cord inflammation. High levels of IL-10, Th2 cytokine, was detected in the cultured lymphocytes, whereas IFN-γ, Th1 cytokine, was down regulated. hand, antigen-immunized rats without molsidomine administration showed severe disease development and secreted higher amounts of IFN- p than molsidomine administered rats, but secreted small amount of IL-10. By above data, it can be said that NO switched the Th1 response toward the Th2 response. These results indicated that NO in immune system comprises both effector(tissue destruction) and regulatory functions (modulation of cytokine response). In conclusion, we revealed for the first time that administration of NO suppresses autoimmune disease by regulating the Th1/Th2 balance.
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