신경계의 대표적 퇴행성 질환언 알츠하이머병 (Alzheimer’s disease, AD)에서 가장 주요한 병리학적 특정은 senile plaques 형성이며, 주 성분은 베타아밀로이드로 단백질로 알려져 있다. 최근 연구에 의하면 proteasome-ubiquitin pathway가 AD, Lewy bodies disease등과 같은 퇴행성 ...
신경계의 대표적 퇴행성 질환언 알츠하이머병 (Alzheimer’s disease, AD)에서 가장 주요한 병리학적 특정은 senile plaques 형성이며, 주 성분은 베타아밀로이드로 단백질로 알려져 있다. 최근 연구에 의하면 proteasome-ubiquitin pathway가 AD, Lewy bodies disease등과 같은 퇴행성 뇌질환과 관련이 있다는 것이 보고되고 있는데, proteasome-ubiquitin pathway는 세포 내에서 단백질 분해의 중요한 기능을 담당하고 있으므로, 본 실험에서는 알츠하이머병에서 중요한 베타아멀로이드와 세포 내의 기능 유지에 중요한 proteasome의 관계를 알아보고자 한다. 베타아밀로이드의 독성을 일으키는 부분으로 알려진 Aβ_(25-35) fragment와 Aβ_(1-42)를 B103 세포 외부에 처리 하고 베타아밀로이드에 의해 세포가 죽어가는 것을 MIT assay로 확인하였다. 외부에 처리된 베타아밀로이드에 의한 독성작용은 베타아밀로이드가 세포 내부로 유입되어서 작용할 수 있는데, 확인을 위하여 세포 외부에 베타아밀로이드를 처리하고 cytosolic fraction을 분리한 후 Western blotting으로 유입된 베타아밀로이드를 확인 할 수 있었다. 또한 면역세포화학염색법을 통하여 세포 내부에 존재하는 베타아밀로이드를 확인하였다. 유입된 베타아밀로이드가 세포 내에 존재하는 proteasome의 활성도에 미치는 영향을 직접 알아보기 위하여 B103 세포에 green fluorescence protein (GFP)를 transfection 한 후 베타아밀로이드를 처리하였다. 베타아밀로드를 처리하면 proteasome inhibitor를 처리한 것과 비슷하게 GFP의 분해가 감소하는 것을 볼 수 있었다. 즉 외부에 처리된 베타아밀로이드에 의해서 proteasome의 기능이 저해되는 것이다. 베타아밀로이드에 의한 proteasome 활성도 저하가 둘 사이의 직접적인 반응에 의해 발생하는 지를 알아보기 위하여 B103 세포에서 proteasome 분획을 얻어서 베타아밀로이드와 반응시킨 후 proteasome 활성도를 측정해 보았다. 이 때 proteasome의 활성도가 베타아밀로이드의 농도에 비례하여 감소하는 것을 볼 수 있었다. 또한 Human APP (Swedish mutant)를 발현하는 알츠하이머병 모델 동물인 Transgenic mice (Tg2576)의 cortex와 hippocampus 부위에서 베타아밀로이드 수치를 ELISA assay를 통해서 측정하였고, 같은 부위에서 proteasome 분획을 얻은 후 proteasome 활성도를 측정하였다. 측정한 결과 베타아밀로이드의 수치는 연령에 비례하여 증가하였고, proteasome의 활성도는 연령에 비례하여 감소하였다. 또한 proteasome의 substrate인 β-catenin의 분해정도도 연령에 비례하여 감소하였다. 본 연구에서는 베타아밀로이드 단백질이 신경 세포의 proteasome 활성을 저해시킨다는 것을 규명하였다. 이러한 연구 결과는 알츠하이머병에서 senile plaques 주변 신경 세포에 베타아밀로이드가 유입되고 그로 인해 proteasome의 기능이 저해됨으로써 신경 세포 사멸이 증가 될 수 있다는 가능성을 시사할 수 있다.
신경계의 대표적 퇴행성 질환언 알츠하이머병 (Alzheimer’s disease, AD)에서 가장 주요한 병리학적 특정은 senile plaques 형성이며, 주 성분은 베타아밀로이드로 단백질로 알려져 있다. 최근 연구에 의하면 proteasome-ubiquitin pathway가 AD, Lewy bodies disease등과 같은 퇴행성 뇌질환과 관련이 있다는 것이 보고되고 있는데, proteasome-ubiquitin pathway는 세포 내에서 단백질 분해의 중요한 기능을 담당하고 있으므로, 본 실험에서는 알츠하이머병에서 중요한 베타아멀로이드와 세포 내의 기능 유지에 중요한 proteasome의 관계를 알아보고자 한다. 베타아밀로이드의 독성을 일으키는 부분으로 알려진 Aβ_(25-35) fragment와 Aβ_(1-42)를 B103 세포 외부에 처리 하고 베타아밀로이드에 의해 세포가 죽어가는 것을 MIT assay로 확인하였다. 외부에 처리된 베타아밀로이드에 의한 독성작용은 베타아밀로이드가 세포 내부로 유입되어서 작용할 수 있는데, 확인을 위하여 세포 외부에 베타아밀로이드를 처리하고 cytosolic fraction을 분리한 후 Western blotting으로 유입된 베타아밀로이드를 확인 할 수 있었다. 또한 면역세포화학염색법을 통하여 세포 내부에 존재하는 베타아밀로이드를 확인하였다. 유입된 베타아밀로이드가 세포 내에 존재하는 proteasome의 활성도에 미치는 영향을 직접 알아보기 위하여 B103 세포에 green fluorescence protein (GFP)를 transfection 한 후 베타아밀로이드를 처리하였다. 베타아밀로드를 처리하면 proteasome inhibitor를 처리한 것과 비슷하게 GFP의 분해가 감소하는 것을 볼 수 있었다. 즉 외부에 처리된 베타아밀로이드에 의해서 proteasome의 기능이 저해되는 것이다. 베타아밀로이드에 의한 proteasome 활성도 저하가 둘 사이의 직접적인 반응에 의해 발생하는 지를 알아보기 위하여 B103 세포에서 proteasome 분획을 얻어서 베타아밀로이드와 반응시킨 후 proteasome 활성도를 측정해 보았다. 이 때 proteasome의 활성도가 베타아밀로이드의 농도에 비례하여 감소하는 것을 볼 수 있었다. 또한 Human APP (Swedish mutant)를 발현하는 알츠하이머병 모델 동물인 Transgenic mice (Tg2576)의 cortex와 hippocampus 부위에서 베타아밀로이드 수치를 ELISA assay를 통해서 측정하였고, 같은 부위에서 proteasome 분획을 얻은 후 proteasome 활성도를 측정하였다. 측정한 결과 베타아밀로이드의 수치는 연령에 비례하여 증가하였고, proteasome의 활성도는 연령에 비례하여 감소하였다. 또한 proteasome의 substrate인 β-catenin의 분해정도도 연령에 비례하여 감소하였다. 본 연구에서는 베타아밀로이드 단백질이 신경 세포의 proteasome 활성을 저해시킨다는 것을 규명하였다. 이러한 연구 결과는 알츠하이머병에서 senile plaques 주변 신경 세포에 베타아밀로이드가 유입되고 그로 인해 proteasome의 기능이 저해됨으로써 신경 세포 사멸이 증가 될 수 있다는 가능성을 시사할 수 있다.
Alzheimer's disease (AD) is an age-related neurodegenerative disorder. Beta-amyloid (A(3) fragments derived from amyloid precursor protein (APP) are the major component of senile plaques which is the pathological hallmarks of AD. Several findings link the proteasome-ubiquitin pathway to some pathlog...
Alzheimer's disease (AD) is an age-related neurodegenerative disorder. Beta-amyloid (A(3) fragments derived from amyloid precursor protein (APP) are the major component of senile plaques which is the pathological hallmarks of AD. Several findings link the proteasome-ubiquitin pathway to some pathlogical manifestations of neurodegenerative disorders such as Alzheimer's disease(AD), Lewy bodies disease. The proteasome-ubiquitin protein degradation pathway is one of the major cellular proteolytic systems. So, we studied the relations between AD and proteasome. Cell viability was assessed using a MTT assay. When B103 cells were treated in the presence of A(325_35 and A(31-42, AD reduced the survivability of B103 cells. To examine A(3 uptake, we used western blotting and immunocytochemistry methods. They revealed that extracellular AD peptides are taken up B103 cells. Fluorescent intensity of GFP by Fluorescence microscopy campared proteasome activity when cells were treated with proteasome inhibitor and A(3. Fluorescence intensity was increased by proteasome inhibitors and A(3. To verify this, total protein from cell treated with proteasome inhibitors and AD was analyzed by western blotting for the detection of GFP. The level of GFP was increased. We determined the effect of AP on the proteolytic activity of 26S proteasome. We shown that A(3 inhibited the chymotrypsin-like activity of the purified proteasome fraction. The inhibition of the chymotrypsin-like activity by A(3 was dose-dependent. We investigated the proteasome activity and API-42 level in animal model of AD(Tg2576). When API-42 level in one quarter brain was detected by API-4z immunoassay kits, API-42 level was increased with aging. The chymotrypsin-like activity of the purified proteasome fraction from brain(cortex, hippocampus) was decreased with aging. Also, degradation of [3 - catenin as a proteasome substrate was decreased with aging. These results suggest that extracellular A(3 peptides enter the cell and inhibit proteasome activation, which may play a role in pathogenesis of AD.
Alzheimer's disease (AD) is an age-related neurodegenerative disorder. Beta-amyloid (A(3) fragments derived from amyloid precursor protein (APP) are the major component of senile plaques which is the pathological hallmarks of AD. Several findings link the proteasome-ubiquitin pathway to some pathlogical manifestations of neurodegenerative disorders such as Alzheimer's disease(AD), Lewy bodies disease. The proteasome-ubiquitin protein degradation pathway is one of the major cellular proteolytic systems. So, we studied the relations between AD and proteasome. Cell viability was assessed using a MTT assay. When B103 cells were treated in the presence of A(325_35 and A(31-42, AD reduced the survivability of B103 cells. To examine A(3 uptake, we used western blotting and immunocytochemistry methods. They revealed that extracellular AD peptides are taken up B103 cells. Fluorescent intensity of GFP by Fluorescence microscopy campared proteasome activity when cells were treated with proteasome inhibitor and A(3. Fluorescence intensity was increased by proteasome inhibitors and A(3. To verify this, total protein from cell treated with proteasome inhibitors and AD was analyzed by western blotting for the detection of GFP. The level of GFP was increased. We determined the effect of AP on the proteolytic activity of 26S proteasome. We shown that A(3 inhibited the chymotrypsin-like activity of the purified proteasome fraction. The inhibition of the chymotrypsin-like activity by A(3 was dose-dependent. We investigated the proteasome activity and API-42 level in animal model of AD(Tg2576). When API-42 level in one quarter brain was detected by API-4z immunoassay kits, API-42 level was increased with aging. The chymotrypsin-like activity of the purified proteasome fraction from brain(cortex, hippocampus) was decreased with aging. Also, degradation of [3 - catenin as a proteasome substrate was decreased with aging. These results suggest that extracellular A(3 peptides enter the cell and inhibit proteasome activation, which may play a role in pathogenesis of AD.
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