[학위논문]혼합염료/은 염색법을 이용한 폴리아크릴아마이드 젤상에서의 염색법연구 The Staining of Proteins on Polyacrylamide Gels by a Counter-ion Dye Staining Technique in Combination with Silver원문보기
폴리아크릴아마이드젤상에서 단백질을 염색하기 위한 방법으로 CBBR같은 염료 염색, 형광염색, 은 염색 등 수많은 염색법이 소개되어왔다. CBBR같은 염료염색은 매우 일반적으로 사용되는 방법이다. 그러나 대부분의 염료염색은 감도에서 BSA기준으로 약 50ng정도로 제한되었다. 은 염색은 나노 그램범위의 소량의 단백질을 탐지하기 위해서 이용된다. 은 염색법의 감도를 향상시키고 은 염색법 절차의 복잡함을 줄이려고 여러 가지 수정되고 개선된 은 염색법이 보고되고 있다. 이 실험에서 혼합염료를 이용하여 은 염색의 감도와 해상도를 향상시킨 혼합염료/은 염색법이 개발되었다. 혼합염료/은 염색법은 폴리아크릴아마이드젤에서 ...
폴리아크릴아마이드젤상에서 단백질을 염색하기 위한 방법으로 CBBR같은 염료 염색, 형광염색, 은 염색 등 수많은 염색법이 소개되어왔다. CBBR같은 염료염색은 매우 일반적으로 사용되는 방법이다. 그러나 대부분의 염료염색은 감도에서 BSA기준으로 약 50ng정도로 제한되었다. 은 염색은 나노 그램범위의 소량의 단백질을 탐지하기 위해서 이용된다. 은 염색법의 감도를 향상시키고 은 염색법 절차의 복잡함을 줄이려고 여러 가지 수정되고 개선된 은 염색법이 보고되고 있다. 이 실험에서 혼합염료를 이용하여 은 염색의 감도와 해상도를 향상시킨 혼합염료/은 염색법이 개발되었다. 혼합염료/은 염색법은 폴리아크릴아마이드젤에서 전기영동 후 분리된 단백질을 혼합염료로 염색한 후 계속해서 은 염색을 한다. 혼합염료염색은 단백질염색 때 낮은 농도의 산성염료와 염기성염료를 같이 사용하는 개량된 염료 염색법이다. 혼합염료/은 염색법은 기존의 은 염색법 (1-10ng of BSA)보다 감도에서 2.5 내지 5배정도 (0.2ng)이고, 염색과정 중에 염색된 단백질 을 관찰하는 것이 가능해서 염색결과를 쉽게 예측할 수 있다. 혼합염료로 calconcarboxylic acid(NN)과 ethyl violet(EV)를 사용하였고, EBT/BCB-silver, AB92/MB-silver를 이용한 혼합염료/은 염색법도 NN/EV-silver를 이용한 혼합 염료/은 염색법처럼 기존의 은 염색법보다 감도와 해상도가 향상되었다. 이 세가지 혼합염료/은 염색법에서 NN, EBT, AB92는 설폰기가 있는 산성 염료이고, EV BCB,MB는 아민기를 지닌 염기성 염료이다. 혼합염료를 이용한 염색에서는 기존의 CBBR과 같은 감도를 나타내는 조건에서도 단백질에 선택적으로 염색되어 염색 중에 탐지되는 단백질을 관찰할 수 있으며 탈 염색과정이 매우 짧아 총 염색시간이 CBBR에 비해 상대적으로 매우 빠르다. 혼합염료염색 후 은 염색으로 가는 과정도 매우 손쉽다. 다환성 방향족 설폰기를 가지고 있는 아조화합물인 NN, EBT, AB92는 단백질과 은 이온에 모든 결합한다. NN, EBT, AB92의 설폰기는 은 염색을 위한 반응장소를 제공해서 은의 핵화를 증진시키고 NN, EBT, AB92의 아조기는 은 이온에 전자를 제공해 줄 수 있어서 은 이온의 환원에 기여하여 은 염색의 감도와 속도를 향상시키는데 기여한다. 기존의 은 염색법보다 감도와 해상도에서 2.5내지 5배정도 향상된 혼합염료/은 염색법은 2D-PAGE에서의 매우 소량의 단백질을 탐지하기 위해서도 사용될 수 있다.
폴리아크릴아마이드젤상에서 단백질을 염색하기 위한 방법으로 CBBR같은 염료 염색, 형광염색, 은 염색 등 수많은 염색법이 소개되어왔다. CBBR같은 염료염색은 매우 일반적으로 사용되는 방법이다. 그러나 대부분의 염료염색은 감도에서 BSA기준으로 약 50ng정도로 제한되었다. 은 염색은 나노 그램범위의 소량의 단백질을 탐지하기 위해서 이용된다. 은 염색법의 감도를 향상시키고 은 염색법 절차의 복잡함을 줄이려고 여러 가지 수정되고 개선된 은 염색법이 보고되고 있다. 이 실험에서 혼합염료를 이용하여 은 염색의 감도와 해상도를 향상시킨 혼합염료/은 염색법이 개발되었다. 혼합염료/은 염색법은 폴리아크릴아마이드젤에서 전기영동 후 분리된 단백질을 혼합염료로 염색한 후 계속해서 은 염색을 한다. 혼합염료염색은 단백질염색 때 낮은 농도의 산성염료와 염기성염료를 같이 사용하는 개량된 염료 염색법이다. 혼합염료/은 염색법은 기존의 은 염색법 (1-10ng of BSA)보다 감도에서 2.5 내지 5배정도 (0.2ng)이고, 염색과정 중에 염색된 단백질 을 관찰하는 것이 가능해서 염색결과를 쉽게 예측할 수 있다. 혼합염료로 calconcarboxylic acid(NN)과 ethyl violet(EV)를 사용하였고, EBT/BCB-silver, AB92/MB-silver를 이용한 혼합염료/은 염색법도 NN/EV-silver를 이용한 혼합 염료/은 염색법처럼 기존의 은 염색법보다 감도와 해상도가 향상되었다. 이 세가지 혼합염료/은 염색법에서 NN, EBT, AB92는 설폰기가 있는 산성 염료이고, EV BCB,MB는 아민기를 지닌 염기성 염료이다. 혼합염료를 이용한 염색에서는 기존의 CBBR과 같은 감도를 나타내는 조건에서도 단백질에 선택적으로 염색되어 염색 중에 탐지되는 단백질을 관찰할 수 있으며 탈 염색과정이 매우 짧아 총 염색시간이 CBBR에 비해 상대적으로 매우 빠르다. 혼합염료염색 후 은 염색으로 가는 과정도 매우 손쉽다. 다환성 방향족 설폰기를 가지고 있는 아조화합물인 NN, EBT, AB92는 단백질과 은 이온에 모든 결합한다. NN, EBT, AB92의 설폰기는 은 염색을 위한 반응장소를 제공해서 은의 핵화를 증진시키고 NN, EBT, AB92의 아조기는 은 이온에 전자를 제공해 줄 수 있어서 은 이온의 환원에 기여하여 은 염색의 감도와 속도를 향상시키는데 기여한다. 기존의 은 염색법보다 감도와 해상도에서 2.5내지 5배정도 향상된 혼합염료/은 염색법은 2D-PAGE에서의 매우 소량의 단백질을 탐지하기 위해서도 사용될 수 있다.
A number of staining methods of proteins have been introduced, like stains by dyes such as CBBR, fluorescent stains, and silver stains. Dye stains such as CBBR are convenient so have been commonly used. However, the sensitivity of most dye stains is limited to about 5Ong of BSA. Silver stains have b...
A number of staining methods of proteins have been introduced, like stains by dyes such as CBBR, fluorescent stains, and silver stains. Dye stains such as CBBR are convenient so have been commonly used. However, the sensitivity of most dye stains is limited to about 5Ong of BSA. Silver stains have been utilized to detect small quantity of proteins. Several modified silver stains have been reported which increase the sensitivity and reduce the difficulties of silver stains. We have developed counter-ion dye enhanced silver staining technique which performs counter-ion dye staining followed by silver nitrate impregnation and development. Counter-ion dye stain is an improved dye staining technique where acidic dyes and basic dyes are used together in staining of proteins. Counter-ion dye enhanced silver staining makes it possible to observe the stained proteins and predict the result in the course of staining and improves the sensitivity (0.2ng) better than that of silver diamine stain (1-10ng). Three counter-ion dye enhanced silver staining techniques have been investigated; NN/EV-silver staining, EBT/BCB-silver staining, and AB92/MB-silver staining. In these counter-ion dye enhanced silver stains, NN, EBT and AB92 are acidic dyes containing sulfonic group, aromatic ring, and azo bridge, and EV, BCB and MB are basic dyes possessing amine group. In stains using counter-ion dye, it has been proven that the background is very low and the staining time becomes shortened compared with CBBR stains showing the similar sensitivity. It is convenient to succeed in silver staining following counter-ion dye stains. NN, EBT, and AB92, azo compounds having polycyclic aromatic sulfonic acid, binds to both protein and silver ion. Sulfonic acid group of NN, EBT and AB92 provides reactive sites for silver staining and so enhances silver nucleation. In addition, azo group of NN, EBT, and AB92 may contribute to silver reduction as a sensitizer when azo group breaks down to N₂ evolution. These can improve the sensitivity of the counter-ion dye enhanced silver stains. This staining method can be applied to detect for the trace amount of protein in 2D-PAGE (0.1-1ng).
A number of staining methods of proteins have been introduced, like stains by dyes such as CBBR, fluorescent stains, and silver stains. Dye stains such as CBBR are convenient so have been commonly used. However, the sensitivity of most dye stains is limited to about 5Ong of BSA. Silver stains have been utilized to detect small quantity of proteins. Several modified silver stains have been reported which increase the sensitivity and reduce the difficulties of silver stains. We have developed counter-ion dye enhanced silver staining technique which performs counter-ion dye staining followed by silver nitrate impregnation and development. Counter-ion dye stain is an improved dye staining technique where acidic dyes and basic dyes are used together in staining of proteins. Counter-ion dye enhanced silver staining makes it possible to observe the stained proteins and predict the result in the course of staining and improves the sensitivity (0.2ng) better than that of silver diamine stain (1-10ng). Three counter-ion dye enhanced silver staining techniques have been investigated; NN/EV-silver staining, EBT/BCB-silver staining, and AB92/MB-silver staining. In these counter-ion dye enhanced silver stains, NN, EBT and AB92 are acidic dyes containing sulfonic group, aromatic ring, and azo bridge, and EV, BCB and MB are basic dyes possessing amine group. In stains using counter-ion dye, it has been proven that the background is very low and the staining time becomes shortened compared with CBBR stains showing the similar sensitivity. It is convenient to succeed in silver staining following counter-ion dye stains. NN, EBT, and AB92, azo compounds having polycyclic aromatic sulfonic acid, binds to both protein and silver ion. Sulfonic acid group of NN, EBT and AB92 provides reactive sites for silver staining and so enhances silver nucleation. In addition, azo group of NN, EBT, and AB92 may contribute to silver reduction as a sensitizer when azo group breaks down to N₂ evolution. These can improve the sensitivity of the counter-ion dye enhanced silver stains. This staining method can be applied to detect for the trace amount of protein in 2D-PAGE (0.1-1ng).
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