[학위논문]무당개구리 세포주 Bok-2의 확립과 항균 펩티드 및 증식 단백질의 분리 Establishment of Cell Line Bok-2 from Bombina orientalis, Amphibia and Isolation of Its Antimicrobial Peptide and Proliferating Increasing Protein원문보기
병원성 미생물들이 만연되어 있는 환경에서, 생명체가 살아가기 위해서는 피부와 같은 상피조직이나 혈류의 면역세포들의 활발한 방어작용이 필요하다. 이런한 상피조직이나 면역세포(탐식세포)들은 미생물들의 세포막 활성을 제해하는 항균단백질을 생산한다. 탐식세포는 탐식작용을 통해 면역반응의 중요 역할을 수행한다. 지난 30년간 탐식세포 활성을 갖는 세포주 개발을 위한 많은 시도가 있었다. 양서류인 Bombina orientalis 로 부터 새로이 탐식세포가 개발되어 Bok-2로 명명하였다. 이 세포주는 배자세포유래로 자연들연변이 현상에 의해 개발되었다. 병원성 미생물(...
병원성 미생물들이 만연되어 있는 환경에서, 생명체가 살아가기 위해서는 피부와 같은 상피조직이나 혈류의 면역세포들의 활발한 방어작용이 필요하다. 이런한 상피조직이나 면역세포(탐식세포)들은 미생물들의 세포막 활성을 제해하는 항균단백질을 생산한다. 탐식세포는 탐식작용을 통해 면역반응의 중요 역할을 수행한다. 지난 30년간 탐식세포 활성을 갖는 세포주 개발을 위한 많은 시도가 있었다. 양서류인 Bombina orientalis 로 부터 새로이 탐식세포가 개발되어 Bok-2로 명명하였다. 이 세포주는 배자세포유래로 자연들연변이 현상에 의해 개발되었다. 병원성 미생물(효모)이 C.albican 과 공동배양되었을 때, 화학주성과 탐식작용 등을 나타내었고, 이로서 Bok-2 세포주는 전문탐식세포(professional phagocyte)임을 밝혔다. 일반 탐식세포는 탐식작용을 한 후 항균단백질을 생산하여 세포내 과립이나 세포 외부로 분비한다. Bok-2 세포에서도 이와 같은 항균단백질을 생산함을 Bokinin--1과 -2 분리를 통해 알 수 있었다. Bokinin--1은 분자량이 4.156 Da 이었고, 양전하를 띠는 소수성 단백질이었다. Bokinin-2는 분자량이 10.501 Da 이었고, 전하를 띠지 않는 소수성 단백질이었다. 한편 미생물을 탐식한 탐식세포는 일반적으로 세포사멸 혹은 세포증식의 단계로 진행된다. Bok-2 세포는 증식기작을 알아보기 위해 2-D 전기영동법을 이용하여, 5개의 새로운, 그리고 6개의 발현 증가된 단백질들을 발견하였다. 본 연구는 전문탐식세포로서 Bok-2 세포주를 확립하여, 이 세포로부터 탐식된 미생물을 살상하는 항균단백질 Bokinin-1과 -2을 분리하였다. 또 탐식작용 후 새로이 혹은 발현 증가된 단백질 11개를 선발하였다. 무혈청배양이 가능한 Bok-2 세포주는 탐식세포내에서 항균단백질 기능 및 이와 관련된 면역학적 연구 뿐만 아니라 항균단백질 대량생산을 위한 세포주 시스템으로 개발하여 생물산업으로의 이용 또한 가능할 것으로 사료된다.
병원성 미생물들이 만연되어 있는 환경에서, 생명체가 살아가기 위해서는 피부와 같은 상피조직이나 혈류의 면역세포들의 활발한 방어작용이 필요하다. 이런한 상피조직이나 면역세포(탐식세포)들은 미생물들의 세포막 활성을 제해하는 항균단백질을 생산한다. 탐식세포는 탐식작용을 통해 면역반응의 중요 역할을 수행한다. 지난 30년간 탐식세포 활성을 갖는 세포주 개발을 위한 많은 시도가 있었다. 양서류인 Bombina orientalis 로 부터 새로이 탐식세포가 개발되어 Bok-2로 명명하였다. 이 세포주는 배자세포유래로 자연들연변이 현상에 의해 개발되었다. 병원성 미생물(효모)이 C.albican 과 공동배양되었을 때, 화학주성과 탐식작용 등을 나타내었고, 이로서 Bok-2 세포주는 전문탐식세포(professional phagocyte)임을 밝혔다. 일반 탐식세포는 탐식작용을 한 후 항균단백질을 생산하여 세포내 과립이나 세포 외부로 분비한다. Bok-2 세포에서도 이와 같은 항균단백질을 생산함을 Bokinin--1과 -2 분리를 통해 알 수 있었다. Bokinin--1은 분자량이 4.156 Da 이었고, 양전하를 띠는 소수성 단백질이었다. Bokinin-2는 분자량이 10.501 Da 이었고, 전하를 띠지 않는 소수성 단백질이었다. 한편 미생물을 탐식한 탐식세포는 일반적으로 세포사멸 혹은 세포증식의 단계로 진행된다. Bok-2 세포는 증식기작을 알아보기 위해 2-D 전기영동법을 이용하여, 5개의 새로운, 그리고 6개의 발현 증가된 단백질들을 발견하였다. 본 연구는 전문탐식세포로서 Bok-2 세포주를 확립하여, 이 세포로부터 탐식된 미생물을 살상하는 항균단백질 Bokinin-1과 -2을 분리하였다. 또 탐식작용 후 새로이 혹은 발현 증가된 단백질 11개를 선발하였다. 무혈청배양이 가능한 Bok-2 세포주는 탐식세포내에서 항균단백질 기능 및 이와 관련된 면역학적 연구 뿐만 아니라 항균단백질 대량생산을 위한 세포주 시스템으로 개발하여 생물산업으로의 이용 또한 가능할 것으로 사료된다.
Survival In a world laden with microorganisms depends on a network of defense mechanism. happened In exterior sites, such as skin, bronchi and gut. and in blood stream leucocytes such as lymphocyte, phagocytes, etc. Animals. having epithelial tissues and phagocytes. have developed antimicrobial pept...
Survival In a world laden with microorganisms depends on a network of defense mechanism. happened In exterior sites, such as skin, bronchi and gut. and in blood stream leucocytes such as lymphocyte, phagocytes, etc. Animals. having epithelial tissues and phagocytes. have developed antimicrobial peptides that can form pores in the cytoplasmic membrane of microorganisms. These antimicrobial molecules include defensins, lysozyme. bactericidal/permeability increasing factor (BPI), cathepsin G. azurocidin and other polypeptides. Phagocytes play an important role in the immune response. such as phagocytosis, secretion of biological active factors including antimicrobial proteins. Over the 30 years, additional strategies have been developed that yield cell lines from phagocytes precursors and their mature progeny residing in a variety of tissues. In this work. phagocytic cell line. Bok-2 has been newly established from Bombina orientalis. in toad, amphibians. Continuous serum-free culture of Bok-2 cell was generated from the primary culture of the tail bud stage embryos. When Bok-2 and viable Candida albicans were co-cultured. Bok-2 cells showed a cascade of immune responses such as chemotaxis, phagocytosis and partial clearing activity of Candida cells and colonies. Based on these results. Bok-2 cell was identified as a professional phagocyte. It is known that phgocytes produce antimicrobial peptides or proteins after phagocytosis, In coincidence with these facts, two hydrophobic proteins designated as Bokinin-1 and Bokinin-2 were identified and characterized by mass spectrometry, amino acid analysis and antimicrobial activity, The molecular masses of the proteins were m/z 4. 156 (Bokinin-1) and 10.501 (Bokinin-2), Bokinin-1 was a cationic and hydrophobic peptide, and Bokinin-2 was a neutral and hydrophobic protein. These two proteins showed antibacterial and antifungal activjties against E. coli, B. megaterium, S. aureus, P. aeruginosa and C. albican. When the phagocytes challenged with bacterial pathogens, progress to cell death or proliferating state. To understand the mechanism of phagocytes proliferation stimulated by bacterial pathogens, we initiated comparative identification of the proteins of activated and non-activated phagocytic cell line, Bok-2. Using a 2-D PAGE technique, we selected eleven protein spots of five new and six up-regulated spots on pathogen activated gel. By MS-FIT data searching program, 57 proteins were recommended from human and Xenopus data banks. In this study, It was demonstrated that as professional phagocytic cell line, Bok-2 cells can be cultured and maintained in serum-free culture condition and produce antimicrobial proteins. Bokinin-1 and -2, and the cells actively proliferate under bacteria challenged condition. The presence of the antimicrobial proteins in phagocytic cell line Bok-2 should facilitate in the study of in vivo role of antimicrobial proteins by experimental infection as well as large scale production of antimicrobial proteins.
Survival In a world laden with microorganisms depends on a network of defense mechanism. happened In exterior sites, such as skin, bronchi and gut. and in blood stream leucocytes such as lymphocyte, phagocytes, etc. Animals. having epithelial tissues and phagocytes. have developed antimicrobial peptides that can form pores in the cytoplasmic membrane of microorganisms. These antimicrobial molecules include defensins, lysozyme. bactericidal/permeability increasing factor (BPI), cathepsin G. azurocidin and other polypeptides. Phagocytes play an important role in the immune response. such as phagocytosis, secretion of biological active factors including antimicrobial proteins. Over the 30 years, additional strategies have been developed that yield cell lines from phagocytes precursors and their mature progeny residing in a variety of tissues. In this work. phagocytic cell line. Bok-2 has been newly established from Bombina orientalis. in toad, amphibians. Continuous serum-free culture of Bok-2 cell was generated from the primary culture of the tail bud stage embryos. When Bok-2 and viable Candida albicans were co-cultured. Bok-2 cells showed a cascade of immune responses such as chemotaxis, phagocytosis and partial clearing activity of Candida cells and colonies. Based on these results. Bok-2 cell was identified as a professional phagocyte. It is known that phgocytes produce antimicrobial peptides or proteins after phagocytosis, In coincidence with these facts, two hydrophobic proteins designated as Bokinin-1 and Bokinin-2 were identified and characterized by mass spectrometry, amino acid analysis and antimicrobial activity, The molecular masses of the proteins were m/z 4. 156 (Bokinin-1) and 10.501 (Bokinin-2), Bokinin-1 was a cationic and hydrophobic peptide, and Bokinin-2 was a neutral and hydrophobic protein. These two proteins showed antibacterial and antifungal activjties against E. coli, B. megaterium, S. aureus, P. aeruginosa and C. albican. When the phagocytes challenged with bacterial pathogens, progress to cell death or proliferating state. To understand the mechanism of phagocytes proliferation stimulated by bacterial pathogens, we initiated comparative identification of the proteins of activated and non-activated phagocytic cell line, Bok-2. Using a 2-D PAGE technique, we selected eleven protein spots of five new and six up-regulated spots on pathogen activated gel. By MS-FIT data searching program, 57 proteins were recommended from human and Xenopus data banks. In this study, It was demonstrated that as professional phagocytic cell line, Bok-2 cells can be cultured and maintained in serum-free culture condition and produce antimicrobial proteins. Bokinin-1 and -2, and the cells actively proliferate under bacteria challenged condition. The presence of the antimicrobial proteins in phagocytic cell line Bok-2 should facilitate in the study of in vivo role of antimicrobial proteins by experimental infection as well as large scale production of antimicrobial proteins.
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