Acetobacter xylinum의 기본적인 분자생물학적 실험 방법을 확립하였다. A. xylinum은 cellulose를 생산하고 cellulose와 세균 균체가 붙어 있어 일반적인 실험방법으로 세균의 파쇄 및 세균추출액의 분리가 어렵기 때문에, A. xylinum을 배양하는 과정에 cellulase를 첨가하여 cellulose를 분해하였고 세균 추출액 및 세균의 DNA를 효과적으로 분리하는데 성공하였다. 또한 A. xylinum는 water-soluble polysaccharide인 acetan을 생산하기 때문에 cetyltrimethylammoniumbromide를 첨가한 변형된 genomic DNA 추출방법을 확립하였으며 high-voltage electroporation 방법과 comjugal transfer 방법을 이용한 DNA의 형질전환 방법을 확립하였다. 또한 A. xylinum과 Escherichia coli에서 사용가능한 shuttle vector를 개발하였다. 확립된 분자생물학적인 실험 방법을 이용하여 A. xylinum BRC7 균주를 대상으로 무작위 돌연변이를 시도하였고, cellulose를 많이 생산하는 균주의 세균 군락이 cellulose를 적게 생산하고 수용성 세포외 다당류인 acetan을 많이 생산하는 균주의 ...
Acetobacter xylinum의 기본적인 분자생물학적 실험 방법을 확립하였다. A. xylinum은 cellulose를 생산하고 cellulose와 세균 균체가 붙어 있어 일반적인 실험방법으로 세균의 파쇄 및 세균추출액의 분리가 어렵기 때문에, A. xylinum을 배양하는 과정에 cellulase를 첨가하여 cellulose를 분해하였고 세균 추출액 및 세균의 DNA를 효과적으로 분리하는데 성공하였다. 또한 A. xylinum는 water-soluble polysaccharide인 acetan을 생산하기 때문에 cetyltrimethylammoniumbromide를 첨가한 변형된 genomic DNA 추출방법을 확립하였으며 high-voltage electroporation 방법과 comjugal transfer 방법을 이용한 DNA의 형질전환 방법을 확립하였다. 또한 A. xylinum과 Escherichia coli에서 사용가능한 shuttle vector를 개발하였다. 확립된 분자생물학적인 실험 방법을 이용하여 A. xylinum BRC7 균주를 대상으로 무작위 돌연변이를 시도하였고, cellulose를 많이 생산하는 균주의 세균 군락이 cellulose를 적게 생산하고 수용성 세포외 다당류인 acetan을 많이 생산하는 균주의 콜로니에 비해서 더 작고 단단하면서 솟아 올라있는 형태로 형성된다는 점을 이용하여, cellulose를 야생종보다 더 많이 생산하는 cellulose 고생산능 균주를 선별하였다. 선별된 cellulose 고생산능 균주는 야생종인 A. xylinum BRC7에 비하여 cellulose의 경우 23% 더 많이 생산하였고, 또다른 세포외 다당류인 acetan은 21% 더 적게 생산하였다. cellulose 고생산능 균주의 무작위 돌연변이가 유도된 부분을 PCR 및 DNA 염기서열 분석 방법을 통해 알아본 결과, Salmonella typhimurium LT2의 dTDP-4-keto-6-deoxyglucose epimerase 유전자 일부와 유사한 것을 확인하였고, 실제로 돌연변이체에서는 dTDP-4-keto-6-deoxyglucose epimerase에 의해서 매개되는 dTDP-4-keto-6-deoxyglucose를 이용하여 rhamnose를 합성하는 과정을 확인할 수 없었다. 무작위 돌연변이로 선별한 cellulose 고생산능 균주가 acetan 생합성과 관련된 유전자의 일부분에 이상이 생긴 것을 이용하여, acetan 생합성 유전자들 중에서 cellulose를 이루는 β-1,4-glucan 구조와 유사한 구조에 처음으로 다른 사슬의 당인 mannose 당이 붙는 과정을 매개하는 GDP-mannosyltransferase를 기능적으로 제거하는 돌연변이체를 개발하였다. 다른 Acetobacter 및 xanthan을 생산하는 Xanthomonas campestris의 GDP-mannosyltransferase의 아미노산 서열로부터 PCR primer를 제작하여 PCR을 수행하였고, A. xylinum KCCM 10100의 GDP-mannosyltransferase 유전자의 일부를 클로닝하였다. 얻어진 A. xylinum KCCM 10100의 GDP-mannosyltransferase의 염기서열로부터 유추된 아미노산 서열을 다른 A. xylinum들의 GDP-mannosyltransferases 아미노산 서열과 비교한 결과 80% 이상의 높은 유사성을 보였다. 따라서 얻어진 A. xylinum KCCM 10100의 GDP-mannosyltransferase 유전자의 일부를 A. xylinum KCCM 10100에서 replication 불가능하고 A. xylinum KCCM 10100에서 사용 가능한 항생제인 chloramphenicol의 내성 유전자를 갖고 있는 plasmid에 넣어서 돌연변이 유도를 위한 벡터 pST210을 제작하였다. 제작된 벡터 pST210을 이용하여 형질전환을 시도하였고, GDP-mannosyltransferase defective 돌연변이체를 선별하였다. 선별된 GDP-mannosyltransferase 제거 돌연변이는 야생종인 A. xylinum KCCM 10100에 비하여 cellulose를 23% 더 많이 생산하였고, 변형된 acetan으로 추정되는 수용성 다당류를 16% 덜 생산하였다. 또한, 수용성 다당류를 분리하여 분석한 결과, GDP-mannosyltransferase 제거 돌연변이체로부터 얻은 수용성 다당류에서는 mannose 당을 확인할 수 없었다.
Acetobacter xylinum의 기본적인 분자생물학적 실험 방법을 확립하였다. A. xylinum은 cellulose를 생산하고 cellulose와 세균 균체가 붙어 있어 일반적인 실험방법으로 세균의 파쇄 및 세균추출액의 분리가 어렵기 때문에, A. xylinum을 배양하는 과정에 cellulase를 첨가하여 cellulose를 분해하였고 세균 추출액 및 세균의 DNA를 효과적으로 분리하는데 성공하였다. 또한 A. xylinum는 water-soluble polysaccharide인 acetan을 생산하기 때문에 cetyltrimethylammoniumbromide를 첨가한 변형된 genomic DNA 추출방법을 확립하였으며 high-voltage electroporation 방법과 comjugal transfer 방법을 이용한 DNA의 형질전환 방법을 확립하였다. 또한 A. xylinum과 Escherichia coli에서 사용가능한 shuttle vector를 개발하였다. 확립된 분자생물학적인 실험 방법을 이용하여 A. xylinum BRC7 균주를 대상으로 무작위 돌연변이를 시도하였고, cellulose를 많이 생산하는 균주의 세균 군락이 cellulose를 적게 생산하고 수용성 세포외 다당류인 acetan을 많이 생산하는 균주의 콜로니에 비해서 더 작고 단단하면서 솟아 올라있는 형태로 형성된다는 점을 이용하여, cellulose를 야생종보다 더 많이 생산하는 cellulose 고생산능 균주를 선별하였다. 선별된 cellulose 고생산능 균주는 야생종인 A. xylinum BRC7에 비하여 cellulose의 경우 23% 더 많이 생산하였고, 또다른 세포외 다당류인 acetan은 21% 더 적게 생산하였다. cellulose 고생산능 균주의 무작위 돌연변이가 유도된 부분을 PCR 및 DNA 염기서열 분석 방법을 통해 알아본 결과, Salmonella typhimurium LT2의 dTDP-4-keto-6-deoxyglucose epimerase 유전자 일부와 유사한 것을 확인하였고, 실제로 돌연변이체에서는 dTDP-4-keto-6-deoxyglucose epimerase에 의해서 매개되는 dTDP-4-keto-6-deoxyglucose를 이용하여 rhamnose를 합성하는 과정을 확인할 수 없었다. 무작위 돌연변이로 선별한 cellulose 고생산능 균주가 acetan 생합성과 관련된 유전자의 일부분에 이상이 생긴 것을 이용하여, acetan 생합성 유전자들 중에서 cellulose를 이루는 β-1,4-glucan 구조와 유사한 구조에 처음으로 다른 사슬의 당인 mannose 당이 붙는 과정을 매개하는 GDP-mannosyltransferase를 기능적으로 제거하는 돌연변이체를 개발하였다. 다른 Acetobacter 및 xanthan을 생산하는 Xanthomonas campestris의 GDP-mannosyltransferase의 아미노산 서열로부터 PCR primer를 제작하여 PCR을 수행하였고, A. xylinum KCCM 10100의 GDP-mannosyltransferase 유전자의 일부를 클로닝하였다. 얻어진 A. xylinum KCCM 10100의 GDP-mannosyltransferase의 염기서열로부터 유추된 아미노산 서열을 다른 A. xylinum들의 GDP-mannosyltransferases 아미노산 서열과 비교한 결과 80% 이상의 높은 유사성을 보였다. 따라서 얻어진 A. xylinum KCCM 10100의 GDP-mannosyltransferase 유전자의 일부를 A. xylinum KCCM 10100에서 replication 불가능하고 A. xylinum KCCM 10100에서 사용 가능한 항생제인 chloramphenicol의 내성 유전자를 갖고 있는 plasmid에 넣어서 돌연변이 유도를 위한 벡터 pST210을 제작하였다. 제작된 벡터 pST210을 이용하여 형질전환을 시도하였고, GDP-mannosyltransferase defective 돌연변이체를 선별하였다. 선별된 GDP-mannosyltransferase 제거 돌연변이는 야생종인 A. xylinum KCCM 10100에 비하여 cellulose를 23% 더 많이 생산하였고, 변형된 acetan으로 추정되는 수용성 다당류를 16% 덜 생산하였다. 또한, 수용성 다당류를 분리하여 분석한 결과, GDP-mannosyltransferase 제거 돌연변이체로부터 얻은 수용성 다당류에서는 mannose 당을 확인할 수 없었다.
High-voltage electroporation method and conjugal transfer were successful in Acetobacter xylinum BRC7 and KCCM 10100. High-voltage electroporation conditions of 25 μF capacitance, 2.5 kV, 400 ohms resistance, and pulse lengths of 7-9 ms were applied to a cell/DNA mixture in a 0.2 cm cuvette. Plasmid...
High-voltage electroporation method and conjugal transfer were successful in Acetobacter xylinum BRC7 and KCCM 10100. High-voltage electroporation conditions of 25 μF capacitance, 2.5 kV, 400 ohms resistance, and pulse lengths of 7-9 ms were applied to a cell/DNA mixture in a 0.2 cm cuvette. Plasmid pST01, Escherichia coli-A. xylinum shuttle vector, was newly developed and transformed at an frequency of 0.6 × 10^(-6) (transformants/survivor). Conjugal transfer was performed using plasposon pTnMod-OTc, developed for direct cloning, and pRK415, general plasmid for conjugation. Plasmid pTnMod-OTc and pRK415 were introduced by a triparental mating. These results will be appropriate genetic analysis and cloning tools for A. xylinum KCCM 10100. A mutant, produces more cellulose and less acetan, was isolated among thirty Acetobacter xylinum BRC7 cells, a cellulose-producing bacterium isolated from vinegar factory in Korea, electrotransformed with plasposon pTnMod-OTc. The amount of cellulose, water-insoluble polysaccharide, produced by the mutant grown in Hestrin-Schramm medium was 23% more than that produced by wild type cell. The amount of acetan, water-soluble polysaccharide, produced by the mutant, on the other hand, was 21% less than that of the wild type. The mutated region by plasposon was cloned using polymerase chain reaction (PCR). The nucleotide sequencses of PCR clone have the similarity to nucleotide sequences of dTDP-4-keto-6-deoxyglucose epimerase fragment from Salmonella typhimurium LT2. dTDP-4-keto-6-deoxyglucose epimerase converts dTDP-4-keto-6-deoxyglucose to dTDP-4-keto-rhamnose and is responsible for a part of acetan biosynthesis. The dTDP-rhamnose production by mutant was not detected in HPLC analysis. However, this by wild type cell was detected. GDP-mannosyltransferase (GMT) is an enzyme responsible for addition of a mannose to glucose (α[1→3]) in the linear -1,4-glucan polymers during biosynthesis of the water-soluble branched polysaccharide acetan in Acetobacter species. In an effort to obtain a cellulose-overproducing bacterium, a mutant defective in GMT of Acetobacter xylinum KCCM 10100 was constructed by single crossover homologous recombination using pGEM-T easy, pHSG398, and part of the aceA gene encoding GMT amplified by polymerase chain reaction. The GMT-disrupted mutant produced 23% more cellulose but 16% less water-soluble polysaccharide than those of the wild type strain. Analysis of sugar composition by gel permeation chromatography after acid hydrolysis revealed that water-soluble polysaccharides produced from the GMT-defective mutant contained no mannose molecule. These results suggest that the sugar molecules usually spent for the biosynthesis of acetan in wild type cells were instead used for cellulose biosynthesis in the GMT-defective mutant, resulting in overproduction of cellulose but no production of the mannose-containing polysaccharide acetan in the A. xylinum KCCM 10100 mutant.
High-voltage electroporation method and conjugal transfer were successful in Acetobacter xylinum BRC7 and KCCM 10100. High-voltage electroporation conditions of 25 μF capacitance, 2.5 kV, 400 ohms resistance, and pulse lengths of 7-9 ms were applied to a cell/DNA mixture in a 0.2 cm cuvette. Plasmid pST01, Escherichia coli-A. xylinum shuttle vector, was newly developed and transformed at an frequency of 0.6 × 10^(-6) (transformants/survivor). Conjugal transfer was performed using plasposon pTnMod-OTc, developed for direct cloning, and pRK415, general plasmid for conjugation. Plasmid pTnMod-OTc and pRK415 were introduced by a triparental mating. These results will be appropriate genetic analysis and cloning tools for A. xylinum KCCM 10100. A mutant, produces more cellulose and less acetan, was isolated among thirty Acetobacter xylinum BRC7 cells, a cellulose-producing bacterium isolated from vinegar factory in Korea, electrotransformed with plasposon pTnMod-OTc. The amount of cellulose, water-insoluble polysaccharide, produced by the mutant grown in Hestrin-Schramm medium was 23% more than that produced by wild type cell. The amount of acetan, water-soluble polysaccharide, produced by the mutant, on the other hand, was 21% less than that of the wild type. The mutated region by plasposon was cloned using polymerase chain reaction (PCR). The nucleotide sequencses of PCR clone have the similarity to nucleotide sequences of dTDP-4-keto-6-deoxyglucose epimerase fragment from Salmonella typhimurium LT2. dTDP-4-keto-6-deoxyglucose epimerase converts dTDP-4-keto-6-deoxyglucose to dTDP-4-keto-rhamnose and is responsible for a part of acetan biosynthesis. The dTDP-rhamnose production by mutant was not detected in HPLC analysis. However, this by wild type cell was detected. GDP-mannosyltransferase (GMT) is an enzyme responsible for addition of a mannose to glucose (α[1→3]) in the linear -1,4-glucan polymers during biosynthesis of the water-soluble branched polysaccharide acetan in Acetobacter species. In an effort to obtain a cellulose-overproducing bacterium, a mutant defective in GMT of Acetobacter xylinum KCCM 10100 was constructed by single crossover homologous recombination using pGEM-T easy, pHSG398, and part of the aceA gene encoding GMT amplified by polymerase chain reaction. The GMT-disrupted mutant produced 23% more cellulose but 16% less water-soluble polysaccharide than those of the wild type strain. Analysis of sugar composition by gel permeation chromatography after acid hydrolysis revealed that water-soluble polysaccharides produced from the GMT-defective mutant contained no mannose molecule. These results suggest that the sugar molecules usually spent for the biosynthesis of acetan in wild type cells were instead used for cellulose biosynthesis in the GMT-defective mutant, resulting in overproduction of cellulose but no production of the mannose-containing polysaccharide acetan in the A. xylinum KCCM 10100 mutant.
AI-Helper
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.