카드뮴에 노출된 붕어의 메탈로치오닌 유전자 발현 및 조직학적 변화에 관한 연구 Studies on the metallothionein gene expression and histophathological changes of crucian carp, Carassius auratus exposed to cadmium원문보기
급속한 공업화와 인구의 도시집중 및 소비증가 등으로 인하여 여러 형태의 다양한 오염물질이 생태계 및 인체에 심각한 영향을 미치게 되었다(Shroeder., 1977, Elinder G., 1986). 특히, 카드뮴, 납, 수은 및 크롬 등 중금속에 의한 생태계 악영향은 그 산업화 과정에 필연적으로 나타나는 환경오염의 결과로서 최근에는 그 위해성에 대한 우려가 날로 증가하고 있는 실정이다. 하천 생태계에 서식하는 생물 중 어류는 미량의 카드뮴에 노출될 경우에도 조직 손상, 척추 변형, 호흡기관 병변 등의 독성학적 영향을 받아 결국 치사에 이르게 된다 (Sorensen, 1991). 하천 생태계에 배출된 카드뮴은 ...
급속한 공업화와 인구의 도시집중 및 소비증가 등으로 인하여 여러 형태의 다양한 오염물질이 생태계 및 인체에 심각한 영향을 미치게 되었다(Shroeder., 1977, Elinder G., 1986). 특히, 카드뮴, 납, 수은 및 크롬 등 중금속에 의한 생태계 악영향은 그 산업화 과정에 필연적으로 나타나는 환경오염의 결과로서 최근에는 그 위해성에 대한 우려가 날로 증가하고 있는 실정이다. 하천 생태계에 서식하는 생물 중 어류는 미량의 카드뮴에 노출될 경우에도 조직 손상, 척추 변형, 호흡기관 병변 등의 독성학적 영향을 받아 결국 치사에 이르게 된다 (Sorensen, 1991). 하천 생태계에 배출된 카드뮴은 생물농축의 경로를 따라 더욱 높은 농도로 인체에 노출되게 되며 따라서 하천의 오염농도에 의한 생물체의 영향을 평가하는 데는 한계가 있으며 본질적으로는 생태계 및 인체에 미치는 영향을 생물학적으로 평가할 수 있는 생체내 지표의 개발이 필요한 실정이다. 이는 기존의 화학적 분석방법만으로는 오염수준의 고저만을 평가할 수 있을 뿐 오염된 수준이 정확히 인체에 미치는 독성학적 영향을 평가하는 데는 한계가 있기 때문이다. 이러한 문제를 인식하고 본 연구에서는 중금속에 특이적으로 유도되며 이에 결합하는 메탈로치오닌 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 이용하여 중금속 오염을 평가할 수 있는 생물학적 지표를 개발하고자 하였다. 아울러 조직학적 병변과 유전자지표의 변화를 상호 비교함으로써 각 생물학적 지표의 특성을 분석, 이를 상호 보완할 수 있는 방법론을 모색하고자 하였다. 이를 위해 본 연구에서는 우선 crucian carp (Carassius auratus) cDNA염기 서열과 genomic DNA의 염기서열을 확인하고 이를 바탕으로 PCR 방법에 의한 유전자 발현의 평가기법을 확립하고자 하였다. 기존의 어류 메탈로치오닌 염기서열을 바탕으로 적정 primer를 합성한 후 이를 이용하여 증폭, 클로닝하여 붕어 메탈로치오닌 cDNA와 gDNA의 전체 염기서열을 확인한 결과 405bp의 gDNA 유전자 염기서열과 183bp에 해당하는 cDNA 염기서열을 확인하였으며 cDNA 서열을 바탕으로 60개의 아미노산 1차구조를 확인하였다. gDNA의 구조를 분석한 결과 3개의 exon과 2개의 intron 구조로 이루어졌으며, 이중 exon 1, 2, 3은 각 각 25, 66, 92bp로 구성되어 있음을 알 수 있었다. 붕어 메탈로치오닌 단백질은 기존의 메탈로치오닌과 마찬가지로 Cystein이 풍부한 펩타이드 구조를 이루고 있었으며 6개의 Cys-X-Cys 형태로 배열된 총 20개의 cystein을 확인하였다. 메탈로치오닌 유전자 발현을 평가하기 위해서는 먼저 붕어의 메탈로치오닌 cDNA 염기서열을 기본으로 적정 PCR 프라이머를 합성한 후 RT-PCR법을 이용하였다. 즉, 메탈로치오닌 유도량을 측정하기 위해 붕어를 25일 동안 0.01, 0.1, 0.5mg/L 농도의 카드뮴에 노출시키고 간, 신장, 아가미 조직으로부터 RNA를 추출한 후 RT-PCR을 수행, 얻어진 cDNA를 가지고 합성한 primer쌍을 이용하여 PCR을 실시한 후 그 산물을 전기영동하여 최종적으로 메탈로치오닌 유전자의 발현을 확인, 비교하였다. 그 결과 아가미가 청정조건에서는 간이나 신장과 달리 매우 낮은 농도 수준으로 발현되고 카드뮴 노출시 간이나 신장과 비교하여 아가미는 메탈로치오닌 mRNA 유도에 있어 가장 민감한 조직으로 확인되었다. 한편, 아가미에서 카드뮴함량은 중금속농도와 노출기간동안 증가한 반면, 메탈로치오닌 mRNA 농도는 1일 후에 급격하게 증가하였고 시간이 지남에 따라 점점 감소하였다. 아가미에 있어서 메탈로치오닌 mRNA 유도는 카드뮴 축적량과 정확히 일치되지는 않는 것으로 나타났다. 붕어의 아가미에 있어서 조직학적 변화와 카드뮴 축적량과의 상관성을 확인하기 위해 0.01, 0.1, 0.5㎎/L의 카드뮴 농도에서 25일간 노출 후 조직을 적출하여 H-E 비교염색과 AB-PAS 반응염색을 시켰다. 조직학적 변화도 점액세포의 산성화, 새판 상피세포의 비후, 이차세엽의 비대, 핵응축 등이 나타났다. 이는 보편적으로 나타나는 어류 아가미 조직에서의 조직병리학적 변화와 같음을 알 수 있었다. 카드뮴을 단독 오염원으로 사용하여 아가미의 조직학적 변화와 조직내 축적 정도와의 상관관계를 살펴보면, 노출 농도별 노출 시간이 경과함에 따라 아가미에 축적되는 양은 증가함을 알 수 있었으며 노출농도가 서로 다를 지라도 아가미에 축적된 카드뮴의 양이 유사할 경우에는 조직학적 변화 양상도 유사하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 또한 아가미 점액세포의 산성화는 카드뮴 축적 양이 5㎍/g 이상에서 나타나는 조직병리학적 증상으로 확인되었는데 이와 같이 조직학적 변화와 카드뮴 축적량과의 상관성을 이용하면 카드뮴 오염지역에 서식하고 있는 붕어에서 아가미의 조직학적 변화를 관찰해 봄으로써 그 지역의 카드뮴 오염정도를 예측할 수 있을 것으로 사료된다. 그리고 아가미 조직내 축적된 카드뮴의 농도에 따른 조직병변과 메탈로치오닌 유전자의 발현과의 상관관계를 살펴보면, 붕어의 경우 조직학적 병변이 나타나지 않는 저농도에서는 메탈로치오닌이 민감하게 발현됨을 확인할 수 있었으므로, RT-PCR 기법과 같은 분자생물학적인 방법이 조직병리학적 변화 양상보다 환경오염원을 보다 민감하게 모니터링 할 수 있는 방법이라 사료되나 카드뮴 축적량과 메탈로치오닌 발현량과는 상호연관이 없는 것으로 나타났으므로, 카드뮴 축적량이 비슷할 경우, 조직학적 변화양상도 비슷하게 나타난 결과를 볼 때, 메탈로치오닌 유전자의 발현과 조직병리학적 변화의 두 지표는 오염지역이나 오염농도에 따라 상호보완적이라 할 수 있겠다. 이로써 본 연구 결과는 메탈로치오닌 유전자의 발현정도와 조직병변 및 생물농축과의 상관관계를 통해 카드뮴이 생태계에 미치는 영향을 보다 민감하게 평가할 수 있는 분자생물학적 방법을 확립하였고, 조직병리학적 병변과 유전자 지표 발현과의 상호보완관계를 확인하였다.
급속한 공업화와 인구의 도시집중 및 소비증가 등으로 인하여 여러 형태의 다양한 오염물질이 생태계 및 인체에 심각한 영향을 미치게 되었다(Shroeder., 1977, Elinder G., 1986). 특히, 카드뮴, 납, 수은 및 크롬 등 중금속에 의한 생태계 악영향은 그 산업화 과정에 필연적으로 나타나는 환경오염의 결과로서 최근에는 그 위해성에 대한 우려가 날로 증가하고 있는 실정이다. 하천 생태계에 서식하는 생물 중 어류는 미량의 카드뮴에 노출될 경우에도 조직 손상, 척추 변형, 호흡기관 병변 등의 독성학적 영향을 받아 결국 치사에 이르게 된다 (Sorensen, 1991). 하천 생태계에 배출된 카드뮴은 생물농축의 경로를 따라 더욱 높은 농도로 인체에 노출되게 되며 따라서 하천의 오염농도에 의한 생물체의 영향을 평가하는 데는 한계가 있으며 본질적으로는 생태계 및 인체에 미치는 영향을 생물학적으로 평가할 수 있는 생체내 지표의 개발이 필요한 실정이다. 이는 기존의 화학적 분석방법만으로는 오염수준의 고저만을 평가할 수 있을 뿐 오염된 수준이 정확히 인체에 미치는 독성학적 영향을 평가하는 데는 한계가 있기 때문이다. 이러한 문제를 인식하고 본 연구에서는 중금속에 특이적으로 유도되며 이에 결합하는 메탈로치오닌 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 이용하여 중금속 오염을 평가할 수 있는 생물학적 지표를 개발하고자 하였다. 아울러 조직학적 병변과 유전자지표의 변화를 상호 비교함으로써 각 생물학적 지표의 특성을 분석, 이를 상호 보완할 수 있는 방법론을 모색하고자 하였다. 이를 위해 본 연구에서는 우선 crucian carp (Carassius auratus) cDNA 염기 서열과 genomic DNA의 염기서열을 확인하고 이를 바탕으로 PCR 방법에 의한 유전자 발현의 평가기법을 확립하고자 하였다. 기존의 어류 메탈로치오닌 염기서열을 바탕으로 적정 primer를 합성한 후 이를 이용하여 증폭, 클로닝하여 붕어 메탈로치오닌 cDNA와 gDNA의 전체 염기서열을 확인한 결과 405bp의 gDNA 유전자 염기서열과 183bp에 해당하는 cDNA 염기서열을 확인하였으며 cDNA 서열을 바탕으로 60개의 아미노산 1차구조를 확인하였다. gDNA의 구조를 분석한 결과 3개의 exon과 2개의 intron 구조로 이루어졌으며, 이중 exon 1, 2, 3은 각 각 25, 66, 92bp로 구성되어 있음을 알 수 있었다. 붕어 메탈로치오닌 단백질은 기존의 메탈로치오닌과 마찬가지로 Cystein이 풍부한 펩타이드 구조를 이루고 있었으며 6개의 Cys-X-Cys 형태로 배열된 총 20개의 cystein을 확인하였다. 메탈로치오닌 유전자 발현을 평가하기 위해서는 먼저 붕어의 메탈로치오닌 cDNA 염기서열을 기본으로 적정 PCR 프라이머를 합성한 후 RT-PCR법을 이용하였다. 즉, 메탈로치오닌 유도량을 측정하기 위해 붕어를 25일 동안 0.01, 0.1, 0.5mg/L 농도의 카드뮴에 노출시키고 간, 신장, 아가미 조직으로부터 RNA를 추출한 후 RT-PCR을 수행, 얻어진 cDNA를 가지고 합성한 primer쌍을 이용하여 PCR을 실시한 후 그 산물을 전기영동하여 최종적으로 메탈로치오닌 유전자의 발현을 확인, 비교하였다. 그 결과 아가미가 청정조건에서는 간이나 신장과 달리 매우 낮은 농도 수준으로 발현되고 카드뮴 노출시 간이나 신장과 비교하여 아가미는 메탈로치오닌 mRNA 유도에 있어 가장 민감한 조직으로 확인되었다. 한편, 아가미에서 카드뮴함량은 중금속농도와 노출기간동안 증가한 반면, 메탈로치오닌 mRNA 농도는 1일 후에 급격하게 증가하였고 시간이 지남에 따라 점점 감소하였다. 아가미에 있어서 메탈로치오닌 mRNA 유도는 카드뮴 축적량과 정확히 일치되지는 않는 것으로 나타났다. 붕어의 아가미에 있어서 조직학적 변화와 카드뮴 축적량과의 상관성을 확인하기 위해 0.01, 0.1, 0.5㎎/L의 카드뮴 농도에서 25일간 노출 후 조직을 적출하여 H-E 비교염색과 AB-PAS 반응염색을 시켰다. 조직학적 변화도 점액세포의 산성화, 새판 상피세포의 비후, 이차세엽의 비대, 핵응축 등이 나타났다. 이는 보편적으로 나타나는 어류 아가미 조직에서의 조직병리학적 변화와 같음을 알 수 있었다. 카드뮴을 단독 오염원으로 사용하여 아가미의 조직학적 변화와 조직내 축적 정도와의 상관관계를 살펴보면, 노출 농도별 노출 시간이 경과함에 따라 아가미에 축적되는 양은 증가함을 알 수 있었으며 노출농도가 서로 다를 지라도 아가미에 축적된 카드뮴의 양이 유사할 경우에는 조직학적 변화 양상도 유사하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 또한 아가미 점액세포의 산성화는 카드뮴 축적 양이 5㎍/g 이상에서 나타나는 조직병리학적 증상으로 확인되었는데 이와 같이 조직학적 변화와 카드뮴 축적량과의 상관성을 이용하면 카드뮴 오염지역에 서식하고 있는 붕어에서 아가미의 조직학적 변화를 관찰해 봄으로써 그 지역의 카드뮴 오염정도를 예측할 수 있을 것으로 사료된다. 그리고 아가미 조직내 축적된 카드뮴의 농도에 따른 조직병변과 메탈로치오닌 유전자의 발현과의 상관관계를 살펴보면, 붕어의 경우 조직학적 병변이 나타나지 않는 저농도에서는 메탈로치오닌이 민감하게 발현됨을 확인할 수 있었으므로, RT-PCR 기법과 같은 분자생물학적인 방법이 조직병리학적 변화 양상보다 환경오염원을 보다 민감하게 모니터링 할 수 있는 방법이라 사료되나 카드뮴 축적량과 메탈로치오닌 발현량과는 상호연관이 없는 것으로 나타났으므로, 카드뮴 축적량이 비슷할 경우, 조직학적 변화양상도 비슷하게 나타난 결과를 볼 때, 메탈로치오닌 유전자의 발현과 조직병리학적 변화의 두 지표는 오염지역이나 오염농도에 따라 상호보완적이라 할 수 있겠다. 이로써 본 연구 결과는 메탈로치오닌 유전자의 발현정도와 조직병변 및 생물농축과의 상관관계를 통해 카드뮴이 생태계에 미치는 영향을 보다 민감하게 평가할 수 있는 분자생물학적 방법을 확립하였고, 조직병리학적 병변과 유전자 지표 발현과의 상호보완관계를 확인하였다.
Metallothioneins (MTs) are a class of inducible metal-binding proteins characterized by low molecular mass (6000-10,000 Da) and lay a major role in detoxification of heavy metals. They are known to be induced by heavy metals in various organs of different species and represent a potential biomarker ...
Metallothioneins (MTs) are a class of inducible metal-binding proteins characterized by low molecular mass (6000-10,000 Da) and lay a major role in detoxification of heavy metals. They are known to be induced by heavy metals in various organs of different species and represent a potential biomarker of aquatic contamination of heavy metals. In this work, cloning and sequencing of a metallothionein gene in crucian carp (Carassius auratus) were done and sensitivities of metallothionein gene expressions in the different tissues of crucian carp to cadmium exposure were compared. Metallothionein gene, lacking 5 promoter region, is 405 bp long and has a tripartite structure consisting of three exons and two introns. The putative open reading frame (ORF) encodes cysteine rich (20 cysteins) polypeptide of 60 amino acids containing 6 Cys-X-Cys motifs, typically found in this protein family. It was found that metallothionin mRNA of gills was not expressed in non-treated fish whereas those of liver and kidneys were detected in the same group by RT-PCR technique using appropriate primers based on the DNA sequence. mRNAs were induced after one-day exposure of cadmium in all the tissues but the expression was most sensitive in gills. In the comparative study of the metallothinein mRNA induction with the histopathological changes of gills during the exposure period of 25 days, any distinct histopathological changes in gills were not observed in one day-cadmium treated fish in which metallothionein mRNA was induced. However, the mRNA levels were decreased after one day as the cumulative cadmium concentration was increased during the rest of exposure period. These results suggested that metallothionein gene expression in gills of crucian carp, Carassius auratus, is a good biomarker to monitor the cadmium contamination on freshwater fish where histological changes are not shown.
Metallothioneins (MTs) are a class of inducible metal-binding proteins characterized by low molecular mass (6000-10,000 Da) and lay a major role in detoxification of heavy metals. They are known to be induced by heavy metals in various organs of different species and represent a potential biomarker of aquatic contamination of heavy metals. In this work, cloning and sequencing of a metallothionein gene in crucian carp (Carassius auratus) were done and sensitivities of metallothionein gene expressions in the different tissues of crucian carp to cadmium exposure were compared. Metallothionein gene, lacking 5 promoter region, is 405 bp long and has a tripartite structure consisting of three exons and two introns. The putative open reading frame (ORF) encodes cysteine rich (20 cysteins) polypeptide of 60 amino acids containing 6 Cys-X-Cys motifs, typically found in this protein family. It was found that metallothionin mRNA of gills was not expressed in non-treated fish whereas those of liver and kidneys were detected in the same group by RT-PCR technique using appropriate primers based on the DNA sequence. mRNAs were induced after one-day exposure of cadmium in all the tissues but the expression was most sensitive in gills. In the comparative study of the metallothinein mRNA induction with the histopathological changes of gills during the exposure period of 25 days, any distinct histopathological changes in gills were not observed in one day-cadmium treated fish in which metallothionein mRNA was induced. However, the mRNA levels were decreased after one day as the cumulative cadmium concentration was increased during the rest of exposure period. These results suggested that metallothionein gene expression in gills of crucian carp, Carassius auratus, is a good biomarker to monitor the cadmium contamination on freshwater fish where histological changes are not shown.
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