Pseudorabies virus(PrV)는 돼지에서 일명 Aujeszky's disease(오제스키병)라고 불리는 중추신경 장애를 주 증상으로 하는 급성 전염병의 원인체이다(Kluge et al., 1992). 허피스바이러스과(Herpesviridae)의 alphavirus아과(Alphaherpesvirinae)에 속하는 Suid alpha herpesvirus Ⅰ으로 virion의 크기는 150-186 nm이며 분자량은 9×10^(7) daltons으로 ...
Pseudorabies virus(PrV)는 돼지에서 일명 Aujeszky's disease(오제스키병)라고 불리는 중추신경 장애를 주 증상으로 하는 급성 전염병의 원인체이다(Kluge et al., 1992). 허피스바이러스과(Herpesviridae)의 alphavirus아과(Alphaherpesvirinae)에 속하는 Suid alpha herpesvirus Ⅰ으로 virion의 크기는 150-186 nm이며 분자량은 9×10^(7) daltons으로 핵산은 150kbp 정도인 double-stranded linear DNA genome으로 구성되어 있고 (Ben-Porat et al., 1979)지금까지 3/4정도의 염기서열이 밝혀졌으며 55개의 유전자가 확인되었다. 162개의 capsomer(12개의 penton, 150개의 hexon)로 구성된 정이십면체 capsid를 가지며 외피에 둘러싸여져 있다. 이 바이러스의 저항성은 열에 약하여 55-60℃에서 30-50분간 가열, 또는 70℃에서는 10분간 가열에 파괴되고, 5 ％석탄산에는 2시간 저항하나 1％ 가성소다에 의해서는 즉각 파괴되는 특징을 가지고 있다. 1902년 헝가리의 Aujeszky에 의 해 공식보고 된 이후 세계의 각국에서 그 질병의 발생이 확인되고 있고(Baskerville et al., 1973), 전 세계적으로 양돈 산업에 가장 경제적인 손실은 주는 질병으로 여겨지고 있다. 우리나라에서는 1980년 이후 혈청학적 검사를 시작하였고 1987년에 경남 양산에서 최초 발생 보고가 있은 후(안 등., 1987) 예방 접종을 실시하지 않고 감염축을 살처분하는 방역정책을 실시하였으나 1989년에는 양산, 김해, 용인, 삼척등지에서, 1990년에는 서산에서 발생 이 보고되는 등 다른 지역으로 지속적으로 확산됨에 따라 1994년 이후 부터는 예방 접종 및 광범위한 혈청학적 검사를 통하여 자연감염 돼지를 도태하는 방향으로 방역정책이 이루어지고 있고, 제 2종 가축전염병으로 지정하여 국가적인 차원에서 방역에 주력하고 있다. PrV는 숙주 영역이 넓어 많은 가축(돼지, 소, 양, 개, 고양이 그리고 조류 등)과 야생동물 및 실험동물(토끼, 밍크, 마우스, 랫트, 기니픽)에 감염된다. 돼지를 제외하고는 소양증 및 신경증상을 주 증상으로 심한 가려움증과 경련, 마비 등 신경증상을 나타낸 후 폐사하기 때문에 개의 광전병과 증상이 유사하여 가성 광견병(pseudorabies)라고 불리고 있다. 돼지에서는 이 질병에 감염되면 다른 동물에서 특징적으로 나타나는 가려움증은 나타나지 않으나 모든 연령에서 발병하고 임상증상은 감염 돼지의 연령과 면역학적 상태에 따라 달라진다(Wittmann and Rziha, 1989). 포유자돈에서는 고열, 구토, 설사, 신경증상 및 혼수를 나타내며 80-90％ 이상의 높은 폐사율을 나타내고, 임신 돈에서는 유사산 등의 번식 장애를 나타내지만 성돈에서는 가벼운 호흡기 증상을 보이다 회복되어 불현성 감염을 일으킨다. 돼지는 자연계의 보균동물로서 바이러스 감염에서 회복된 개체는 불현성 잠복 감염 상태로 보균 동물로 남아 있게 되는데, 잠복 감염개체가 각종 스트레스를 받게 되면 재발되어 비루나 재채기, 기침을 할 때 배출되는 비말을 통해 바이러스를 배출하게 되고(Rock, 1993)다른 개체에 전피시킨다(Wittmann et al., 1983, Enquist et al.,2002). 뇌 조직에 잠복 감염을 일으키므로 그 제어가 어려우며 잠복 감염 돼지는 같은 무리의 돼지뿐만아니라 여러 감수성 있는 동물에 대한 전염원이 되며, 돼지 이외의 감수성 동물에서도 잠복 감염이 성립된다. 현재 방역 대책으로는 정기적인 혈청학적 검사로 청정상태를 확인하고 있으나 혈청학적 경사로는 잠복 감염되어 있는 개체를 파악할 수 없어 잠복 감염 바이러스를 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 진단방법이 필요하다. 또한, 현재 이용되고 있는 백신 접종으로는 잠복 감염에 대하여 방어를 할 수 없어 잠복 감염에 방어할 수 있는 예방 방법이 좀 더 연구되어야 할 것으로 판단된다. 현재 오제스키병 바이러스를 확인하기 위한 진단법으로는 조직절편을 이용한 형광 항체법, immuogold 염색에 의한 항원검출법, 면역확산법, countercurrent immunoelectrophoresis, 중화시험법, ELISA등의 항체검출법이 널리 보고 되어져 왔으나 (Banks and Cartwright, 1983, Allan et al., 1984; Ducatelle et al., 1984), 이러한 진단법으로는 불현성 잠복감염의 진단에는 어려움이 있었다. PrV의 불현성 잠복 감염 상태를 조사하기 위하여 여러 가지 방법이 이용되어져 왔는데(Beran et al., 1980; Maes and Thacker, 1988; Lokensgard et al., 1990; Schang and Osorio, 1994; Denis et al., 1997), 감염조직의 explantation과 co-cultivation에 기초한 방법들은 시간이 오래 걸리고 민감도도 상당히 낮은 반면에(Sabo and Rajcani, 1976; Beran et al., 1980), DNA 탐식자를 이용한 DNA-DNA hybridization 방법 등의 분자생물학적인 방법들이 응용되면서 PrV latency의 검출 민감도와 정확도가 증가되었다(McFarlane et al., 1986; Lokensgard et at., 1990). 최근에는 primer와 chemilimunescent probe를 함께 증폭시키는 정량 PCR 방법이 많이 이용되고 있다(Schang and Osorio, 1994). 특히 실시간중합효소연쇄반응은 감염조직에서 지속적으로 존재하는 감염 바이러스의 확한 양을 검출할 수 있고 그 민감도가 상당히 높은 장점을 가지고 있어 그 사용이 계속 증가되고 있다(Krumbholz et al. 2003; Ozoemena et al., 2004; Mumford et al.,2004). 많은 연구에서 삼차신경절(Trigeminal ganglion; TG), 오구(Olfactory bulb; OB), 뇌 간(Brain stem; BS)과 편도(Tonsils)등의 다양한 신경 조직에서 PrV 잠복 감염에 대한 PCR방법의 가치가 증명되어져 왔으나(Lokensgard et al., 1991;Aberle and Puchhammer-Stock1, 2002), 일반적인 PCR 방법으로는 잠복 감염된 바이러스의 정확한 양을 검출하기가 어렵고 그 민감도도 낮다고 보고되었다(Schang et al., 1994; Thiery et al.,1996; Denis et al.,1997). 이에 본 연구 1장에서는 혈청 검사에서 오제스키병 양성인 돼지 뇌 조직 genomic DNA를 대상으로 하여 nested PCR과 실시간중합효소연쇄반응(real-time PCR)항법을 이용하여 잠복 감염되어 있는 바이러스를 확인하고, 그 분포와 존재하는 양에 대하여 조사하였다. 이는 PCR법을 이용하여 잠복 감염되어 있는 바이러스를 빠르게 진단하여 오제스키병 양성 돼지를 검색하는데 이용할 수 있고, 혈청학적으로 양성인 돼지에서 실제로 바이러스가 잠복 감염되어 있는 개체 분포를 조사하여 잠복 감염되어 있는 바이러스의 실상을 파악하여 오제스키병의 방역에 도움이 되고, 혈청학적으로 음성인-돼지에서 잠복 감염되어 있는 바이러스의 검색에도 이용되어질 수 있을 것으로 판단된다. 또한, 일반적인 PCR 방법보다 민감도를 높이기 위하여 nested PCR 방법을 이용하였으며 false-negative반응을 최소화하기 위하여 세 가지 신경조직(BS, OB 및 TG)의 genomic DNA를 서로 다른 PrV glycoprotein(gB, gG, gE) 유전자를 목표로 하여 nested PCR을 수행하였으며, 바이러스의 정확한 양을 알고자 2가지의 primer와 TaqMan probe를 이용하여 바이러스의 양을 조사하였다. 전 세계적으로 양돈 산업에서 오제스키 병의 방역에 백신접종은 필수불가결하게 여겨지고 있다(Morrison and Thawley, 1989; van Oirschot et al., 1990). PrV 백신은 유전자 변형 생백신(modified live virus vaccine), 불활화 사독 백신(inactivated virus vaccine) 및 유전자 결손 백신(gene-deleted vaccine)둥이 널리 이용되어지고 있다. 약독화 PrV는 많은 종류의 바이러스주가 개발되었고, 바이러스의 약독화 정도는 변이된 유전자 부분과 바이러스주에 따라 다양하게 나타난다(van Oirschot and Gielkens, 1984). 여러 나라에서 생독 백신주로 쓰이는 있는 Bartha 및 Norden strain은 수많은 배양을 통하여 돼지에는 형원성이 약화된 상태이며 이들 바이러스는 genome의 short unique(Us) region이 결실되어 있으며 tk^(+)(Thymidine Kinase)를 나타낸다(Berns et al., 1985). 이 효소는 배양세포에서의 바이러스 성장에는 필수적인 것은 아니나, 생체내에서 바이러스의 neurovirulence나 잠복 감염 형성을 결정짓는데 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다(Tenser et al., 1979; Larder et al., 1973; lomnlczi et al.,1984). 반면, tk^(-) PrV는 이들 Us region 결실 변이주에 비하여 병원성이 더 낮고 잠복 감염의 위험성 역시 덜 하며 면역원성이 우수하고, 역변이가 쉽게 일어나지 않는 안정된 성상을 가지고 있다(McFarland and Hill, 1987; Kit et an., 1985). 약독화 바이러스를 이용한 백신은 일반적으로 면역반응이 오래 지속되고(Stegeman et al., 1994), 다양한 정도로 임상증상을 완화시키며 체액성 면역반응과 세포성 면역반응을 유도시켜 배출되는 바이러스의 양을 감소시킨 것으로 보고되었다(Kelling et al., 1983; Riviere et al., 1992; Vilinis et al., 19981 van Rooij et al.,2004). 또한, 백신 접종군에서 야외 바이러스에 감염된 개체를 판별하기 위한 'marker' 백신으로서의 가치도 가지고 있는 것으로 알려져 있다(Kit et al, 1990; van Oirschot et al., 1990). 유전자 변형 생백신을 이용하여 임상증상의 완화, 배출되는 바이러스의 양 감소 및 성립되는 latency load도 감소하고(Vilinis et al., 1998), 실험 감염에 대하여 충분한 방어능이 형성된다고 보고되기도 하였다(Puentes et al., 1993; Takada et al., 1994). 오제스키병 불활화 또는 subunit 백신의 경우 약독화 백신보다 백신 접종 후 야외 병원성 바이러스에 감염되었을때 배출되는 병원성 바이러스의 양과 배출 기간을 효과적으로 감소시킬 수 있으며, 첨가된 adjuvant의 특성에 따라 각기 다른 다양한 면역반응을 나타낸다고 보고되었다(McGinley and Platt, 1989; Takada et al., 1994; Katayama et al., 1998; van Rooij et al., 2004). 그러나, 잠복 감염을 효과적으로 예방하기 위해서는 불활화 백신보다는 약독화 생백신을 사용하여야 하며 오제스키 병 근절정책으로 불활화 백신만을 사용하면 국가들이 최근에는 유전자 변형 약독화 생 백신의 사용을 권장하고 있다(McInerney and Kooij, 1997; Moynagh, 1997). 또한, 불충분한 약독화나 병원성을 약독화 시킬수록 면역원성이 감소하는 불안정의 문제를 가지고 있어, 현존하는 백신 바이러스 주보다 유전적으로 안정하고 충분한 면역원성을 가지는 백신주의 개발이 요구되어지고 있다(Pensaert et al., 1992). 본 연구의 2장에서는 3가지 형태의 백신(약독화 생백신, 불활화 사독 백신 및 oil-adjuvant가 포함된 gene-deleted subunit 백신)을 사용하여 백신 형태 에 따른 백신의 효과를 비교 조사하였으며, 접종 경로(비강접종 또는 근육내 접종)에 따른 백신의 효과도 비교 조사하였으며, 한국에서 분리한 tk^(-) PrV Yangsan strain을 약독화 생백신으로 이용하여 마우스를 실험 모델로 하여 병원성 PrV에 대한 잠복 감염에 대한 방어 여부를 관찰하여 백신주로서의 안정성과 면역원성을 조사하였다. 또한, 병원성 PrV Yangsan strain을 불활화 시킨 단백질 항원 사독 백신과 oil-adjuvant gene-deleted subunit 백신을 이용하여 약독화 생 백신의 면역원성과 방어 면역 능력을 비교 조사하여 백신 형태에 따른 백신 효능을 비교하였다. 생물학적인 불안정성을 최소화하고 충분한 면역원성을 가지는 백신의 대안으로 최근에는 외래항원을 발현하는 플라스미드 DNA를 이용한 백신이 많이 개발되어 이용하고 있다(Tang et al., 1992; Fynan et al., 1993; Ulmer et al., 1996). PrV를 대상으로 플라스미드 DNA 백신의 장점에 대한 연구가 진행되어 왔다(Chang et al., 1998; Garinendia et al., 1998; van Rooij et al., 1998; Hong et al., 2002). PrV 바이러스의 외피(envelope)에는 숙주세포에 침입과 감염에 중요한 역할을 하는 여러 envelope glycoprotein이 포함되어 있는데(Wittmann and Rziha, 1989), 감염된 숙주의 면역반응을 일으키는 항원으로서 작용하고 있다(Marchioli et al., 1987; Mettenleiter, 1994). 지금까지 10개의 glycoprotein이 확인되었으며, 그 중에서 gC, gE, gG, gI 및 gM은 nonessential glycoprotein으로 바이러스의 복제에 필수적인 glycoprotein은 아니다. 반면에 gB, gD, gH, gK 및 gL는 바이러스의 복제에 필수적인 glycoprotein으로 알려져 있다(Mettenleiter, 1994; Mettenleiter, 1996). PrV gB, gC와 gD는 주요 면역원성 단백질로 in vivo와 in vitro에서 면역반응을 유도하는 항원으로 알려지고 있다(Marchioli et al., 1987, Zuckermann et al., 1990; Kimman, 1992; Hong et al.,2002; Weigel et al., 2003). 서로 다른 접종 경로와 다양한 용량을 응용한 연구에서 PrV gB, gC 및 gD가 돼지에서 방어면역에 관여하는 주 envelope 단백이고(Gerdts et al., 1997; Haagmans et al., 1999), 중화항체가, CTL, lymphoproliferation assay등의 방법을 이용하여 특이 면역반응을 확인한 결과 CD4^(+)Th1-type에 의한 면역반응이 강하게 나타남을 확인하였다(Ho et al., 1998; Hwang et al., 2001; Hong et al., 2002). 강한 면역 반응 유도하기 위하여 GM-CSE와 같은 genetic adjuvant를 이용하여 면역반응을 강화시켰고(Somasundaram et al., 1999; Dufour et al.,2000), 일반적인 DNA 백신의 안전성을 개선하고 면역반응을 증강시키기 위하여 alphavirus-based expression vector를 이용하여 일반적인 플라스미드 DNA 백신과 비교하여 세포성 면역이 증가하고 방어면역능력도 증가하여 백신의 효능이 증가된다고 보고되었다(Dubensky et al., 1996; Berglund et al., 1998; Londstrom,2000; Dufour and Boisseson, 2003; Xiao et al., 2004). 또한, 돼지에서 발병하는 PrV가 마우스, 래트, racoon 및 야생토끼를 포함하는 야생포유류에서 치명적이라는 보고가 있은 후(Field and Hill, 1975; Maes et al., 1979; Kirkpatrick et at., 1980; Thawley and Wright, 1982), 돼지외의 동물모델을 이용하여 PrV에 대한 연구가 진행되어져 왔다(Jakubik, 1977; Bianchi et al., 1998). 화이트 마우스에서 사독백신으로 백신 연구의 가능성을 제시한 이래로(Neukirch and Bauer, 1977) 약독화 백신, 유전자 변형 생 백신(McFarland and Hill, 1987; Takada et al., 1994) 및 DNA 백신(Chang et al., 1998, Garmendia et al., 1998)을 적용하여 PrV백신 연구에 적합한 모델로서 제시되어 왔다. 본 연구의 3장에서는 pCI-neo eukaryotic mammnlina vector에 PrV gB, gC, gD를 각각 재조합하여 만든 플라스미드 DNA 백신 및 이들을 각기 혼합한 cocktail 백신의 면역반응을 C57BL/6(H-2^(b)) 마우스를 실험 모델로 하여 병원성 PrV Yangsan strain에 대한 면역반응과 방어면역에 관하여 조사하였으며, 한국에서 분리한 병원성 PrV Yangsan strain에 대한 면역반응을 관찰하여 우리나라에서 플라스미드 DNA 백신의 응용 가능성과 강한 면역원성을 가지며 방어면역능력을 나타내는 항원으로 작용하는 적합한 glycoprotein에 대하여 조사하였다. 또한, 마우스 모델을 이용하여 병원성 PrV Yangsan strain에 대한 약독화 생백신, 사독 백신, adjuvant가 포함된 subunit 백신 및 glycoprotein을 발현하는 DNA 백신의 면역반응과 방어면역에 관하여 조사하였다.
Pseudorabies virus(PrV)는 돼지에서 일명 Aujeszky's disease(오제스키병)라고 불리는 중추신경 장애를 주 증상으로 하는 급성 전염병의 원인체이다(Kluge et al., 1992). 허피스바이러스과(Herpesviridae)의 alphavirus아과(Alphaherpesvirinae)에 속하는 Suid alpha herpesvirus Ⅰ으로 virion의 크기는 150-186 nm이며 분자량은 9×10^(7) daltons으로 핵산은 150kbp 정도인 double-stranded linear DNA genome으로 구성되어 있고 (Ben-Porat et al., 1979)지금까지 3/4정도의 염기서열이 밝혀졌으며 55개의 유전자가 확인되었다. 162개의 capsomer(12개의 penton, 150개의 hexon)로 구성된 정이십면체 capsid를 가지며 외피에 둘러싸여져 있다. 이 바이러스의 저항성은 열에 약하여 55-60℃에서 30-50분간 가열, 또는 70℃에서는 10분간 가열에 파괴되고, 5 ％석탄산에는 2시간 저항하나 1％ 가성소다에 의해서는 즉각 파괴되는 특징을 가지고 있다. 1902년 헝가리의 Aujeszky에 의 해 공식보고 된 이후 세계의 각국에서 그 질병의 발생이 확인되고 있고(Baskerville et al., 1973), 전 세계적으로 양돈 산업에 가장 경제적인 손실은 주는 질병으로 여겨지고 있다. 우리나라에서는 1980년 이후 혈청학적 검사를 시작하였고 1987년에 경남 양산에서 최초 발생 보고가 있은 후(안 등., 1987) 예방 접종을 실시하지 않고 감염축을 살처분하는 방역정책을 실시하였으나 1989년에는 양산, 김해, 용인, 삼척등지에서, 1990년에는 서산에서 발생 이 보고되는 등 다른 지역으로 지속적으로 확산됨에 따라 1994년 이후 부터는 예방 접종 및 광범위한 혈청학적 검사를 통하여 자연감염 돼지를 도태하는 방향으로 방역정책이 이루어지고 있고, 제 2종 가축전염병으로 지정하여 국가적인 차원에서 방역에 주력하고 있다. PrV는 숙주 영역이 넓어 많은 가축(돼지, 소, 양, 개, 고양이 그리고 조류 등)과 야생동물 및 실험동물(토끼, 밍크, 마우스, 랫트, 기니픽)에 감염된다. 돼지를 제외하고는 소양증 및 신경증상을 주 증상으로 심한 가려움증과 경련, 마비 등 신경증상을 나타낸 후 폐사하기 때문에 개의 광전병과 증상이 유사하여 가성 광견병(pseudorabies)라고 불리고 있다. 돼지에서는 이 질병에 감염되면 다른 동물에서 특징적으로 나타나는 가려움증은 나타나지 않으나 모든 연령에서 발병하고 임상증상은 감염 돼지의 연령과 면역학적 상태에 따라 달라진다(Wittmann and Rziha, 1989). 포유자돈에서는 고열, 구토, 설사, 신경증상 및 혼수를 나타내며 80-90％ 이상의 높은 폐사율을 나타내고, 임신 돈에서는 유사산 등의 번식 장애를 나타내지만 성돈에서는 가벼운 호흡기 증상을 보이다 회복되어 불현성 감염을 일으킨다. 돼지는 자연계의 보균동물로서 바이러스 감염에서 회복된 개체는 불현성 잠복 감염 상태로 보균 동물로 남아 있게 되는데, 잠복 감염개체가 각종 스트레스를 받게 되면 재발되어 비루나 재채기, 기침을 할 때 배출되는 비말을 통해 바이러스를 배출하게 되고(Rock, 1993)다른 개체에 전피시킨다(Wittmann et al., 1983, Enquist et al.,2002). 뇌 조직에 잠복 감염을 일으키므로 그 제어가 어려우며 잠복 감염 돼지는 같은 무리의 돼지뿐만아니라 여러 감수성 있는 동물에 대한 전염원이 되며, 돼지 이외의 감수성 동물에서도 잠복 감염이 성립된다. 현재 방역 대책으로는 정기적인 혈청학적 검사로 청정상태를 확인하고 있으나 혈청학적 경사로는 잠복 감염되어 있는 개체를 파악할 수 없어 잠복 감염 바이러스를 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 진단방법이 필요하다. 또한, 현재 이용되고 있는 백신 접종으로는 잠복 감염에 대하여 방어를 할 수 없어 잠복 감염에 방어할 수 있는 예방 방법이 좀 더 연구되어야 할 것으로 판단된다. 현재 오제스키병 바이러스를 확인하기 위한 진단법으로는 조직절편을 이용한 형광 항체법, immuogold 염색에 의한 항원검출법, 면역확산법, countercurrent immunoelectrophoresis, 중화시험법, ELISA등의 항체검출법이 널리 보고 되어져 왔으나 (Banks and Cartwright, 1983, Allan et al., 1984; Ducatelle et al., 1984), 이러한 진단법으로는 불현성 잠복감염의 진단에는 어려움이 있었다. PrV의 불현성 잠복 감염 상태를 조사하기 위하여 여러 가지 방법이 이용되어져 왔는데(Beran et al., 1980; Maes and Thacker, 1988; Lokensgard et al., 1990; Schang and Osorio, 1994; Denis et al., 1997), 감염조직의 explantation과 co-cultivation에 기초한 방법들은 시간이 오래 걸리고 민감도도 상당히 낮은 반면에(Sabo and Rajcani, 1976; Beran et al., 1980), DNA 탐식자를 이용한 DNA-DNA hybridization 방법 등의 분자생물학적인 방법들이 응용되면서 PrV latency의 검출 민감도와 정확도가 증가되었다(McFarlane et al., 1986; Lokensgard et at., 1990). 최근에는 primer와 chemilimunescent probe를 함께 증폭시키는 정량 PCR 방법이 많이 이용되고 있다(Schang and Osorio, 1994). 특히 실시간중합효소연쇄반응은 감염조직에서 지속적으로 존재하는 감염 바이러스의 확한 양을 검출할 수 있고 그 민감도가 상당히 높은 장점을 가지고 있어 그 사용이 계속 증가되고 있다(Krumbholz et al. 2003; Ozoemena et al., 2004; Mumford et al.,2004). 많은 연구에서 삼차신경절(Trigeminal ganglion; TG), 오구(Olfactory bulb; OB), 뇌 간(Brain stem; BS)과 편도(Tonsils)등의 다양한 신경 조직에서 PrV 잠복 감염에 대한 PCR방법의 가치가 증명되어져 왔으나(Lokensgard et al., 1991;Aberle and Puchhammer-Stock1, 2002), 일반적인 PCR 방법으로는 잠복 감염된 바이러스의 정확한 양을 검출하기가 어렵고 그 민감도도 낮다고 보고되었다(Schang et al., 1994; Thiery et al.,1996; Denis et al.,1997). 이에 본 연구 1장에서는 혈청 검사에서 오제스키병 양성인 돼지 뇌 조직 genomic DNA를 대상으로 하여 nested PCR과 실시간중합효소연쇄반응(real-time PCR)항법을 이용하여 잠복 감염되어 있는 바이러스를 확인하고, 그 분포와 존재하는 양에 대하여 조사하였다. 이는 PCR법을 이용하여 잠복 감염되어 있는 바이러스를 빠르게 진단하여 오제스키병 양성 돼지를 검색하는데 이용할 수 있고, 혈청학적으로 양성인 돼지에서 실제로 바이러스가 잠복 감염되어 있는 개체 분포를 조사하여 잠복 감염되어 있는 바이러스의 실상을 파악하여 오제스키병의 방역에 도움이 되고, 혈청학적으로 음성인-돼지에서 잠복 감염되어 있는 바이러스의 검색에도 이용되어질 수 있을 것으로 판단된다. 또한, 일반적인 PCR 방법보다 민감도를 높이기 위하여 nested PCR 방법을 이용하였으며 false-negative반응을 최소화하기 위하여 세 가지 신경조직(BS, OB 및 TG)의 genomic DNA를 서로 다른 PrV glycoprotein(gB, gG, gE) 유전자를 목표로 하여 nested PCR을 수행하였으며, 바이러스의 정확한 양을 알고자 2가지의 primer와 TaqMan probe를 이용하여 바이러스의 양을 조사하였다. 전 세계적으로 양돈 산업에서 오제스키 병의 방역에 백신접종은 필수불가결하게 여겨지고 있다(Morrison and Thawley, 1989; van Oirschot et al., 1990). PrV 백신은 유전자 변형 생백신(modified live virus vaccine), 불활화 사독 백신(inactivated virus vaccine) 및 유전자 결손 백신(gene-deleted vaccine)둥이 널리 이용되어지고 있다. 약독화 PrV는 많은 종류의 바이러스주가 개발되었고, 바이러스의 약독화 정도는 변이된 유전자 부분과 바이러스주에 따라 다양하게 나타난다(van Oirschot and Gielkens, 1984). 여러 나라에서 생독 백신주로 쓰이는 있는 Bartha 및 Norden strain은 수많은 배양을 통하여 돼지에는 형원성이 약화된 상태이며 이들 바이러스는 genome의 short unique(Us) region이 결실되어 있으며 tk^(+)(Thymidine Kinase)를 나타낸다(Berns et al., 1985). 이 효소는 배양세포에서의 바이러스 성장에는 필수적인 것은 아니나, 생체내에서 바이러스의 neurovirulence나 잠복 감염 형성을 결정짓는데 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다(Tenser et al., 1979; Larder et al., 1973; lomnlczi et al.,1984). 반면, tk^(-) PrV는 이들 Us region 결실 변이주에 비하여 병원성이 더 낮고 잠복 감염의 위험성 역시 덜 하며 면역원성이 우수하고, 역변이가 쉽게 일어나지 않는 안정된 성상을 가지고 있다(McFarland and Hill, 1987; Kit et an., 1985). 약독화 바이러스를 이용한 백신은 일반적으로 면역반응이 오래 지속되고(Stegeman et al., 1994), 다양한 정도로 임상증상을 완화시키며 체액성 면역반응과 세포성 면역반응을 유도시켜 배출되는 바이러스의 양을 감소시킨 것으로 보고되었다(Kelling et al., 1983; Riviere et al., 1992; Vilinis et al., 19981 van Rooij et al.,2004). 또한, 백신 접종군에서 야외 바이러스에 감염된 개체를 판별하기 위한 'marker' 백신으로서의 가치도 가지고 있는 것으로 알려져 있다(Kit et al, 1990; van Oirschot et al., 1990). 유전자 변형 생백신을 이용하여 임상증상의 완화, 배출되는 바이러스의 양 감소 및 성립되는 latency load도 감소하고(Vilinis et al., 1998), 실험 감염에 대하여 충분한 방어능이 형성된다고 보고되기도 하였다(Puentes et al., 1993; Takada et al., 1994). 오제스키병 불활화 또는 subunit 백신의 경우 약독화 백신보다 백신 접종 후 야외 병원성 바이러스에 감염되었을때 배출되는 병원성 바이러스의 양과 배출 기간을 효과적으로 감소시킬 수 있으며, 첨가된 adjuvant의 특성에 따라 각기 다른 다양한 면역반응을 나타낸다고 보고되었다(McGinley and Platt, 1989; Takada et al., 1994; Katayama et al., 1998; van Rooij et al., 2004). 그러나, 잠복 감염을 효과적으로 예방하기 위해서는 불활화 백신보다는 약독화 생백신을 사용하여야 하며 오제스키 병 근절정책으로 불활화 백신만을 사용하면 국가들이 최근에는 유전자 변형 약독화 생 백신의 사용을 권장하고 있다(McInerney and Kooij, 1997; Moynagh, 1997). 또한, 불충분한 약독화나 병원성을 약독화 시킬수록 면역원성이 감소하는 불안정의 문제를 가지고 있어, 현존하는 백신 바이러스 주보다 유전적으로 안정하고 충분한 면역원성을 가지는 백신주의 개발이 요구되어지고 있다(Pensaert et al., 1992). 본 연구의 2장에서는 3가지 형태의 백신(약독화 생백신, 불활화 사독 백신 및 oil-adjuvant가 포함된 gene-deleted subunit 백신)을 사용하여 백신 형태 에 따른 백신의 효과를 비교 조사하였으며, 접종 경로(비강접종 또는 근육내 접종)에 따른 백신의 효과도 비교 조사하였으며, 한국에서 분리한 tk^(-) PrV Yangsan strain을 약독화 생백신으로 이용하여 마우스를 실험 모델로 하여 병원성 PrV에 대한 잠복 감염에 대한 방어 여부를 관찰하여 백신주로서의 안정성과 면역원성을 조사하였다. 또한, 병원성 PrV Yangsan strain을 불활화 시킨 단백질 항원 사독 백신과 oil-adjuvant gene-deleted subunit 백신을 이용하여 약독화 생 백신의 면역원성과 방어 면역 능력을 비교 조사하여 백신 형태에 따른 백신 효능을 비교하였다. 생물학적인 불안정성을 최소화하고 충분한 면역원성을 가지는 백신의 대안으로 최근에는 외래항원을 발현하는 플라스미드 DNA를 이용한 백신이 많이 개발되어 이용하고 있다(Tang et al., 1992; Fynan et al., 1993; Ulmer et al., 1996). PrV를 대상으로 플라스미드 DNA 백신의 장점에 대한 연구가 진행되어 왔다(Chang et al., 1998; Garinendia et al., 1998; van Rooij et al., 1998; Hong et al., 2002). PrV 바이러스의 외피(envelope)에는 숙주세포에 침입과 감염에 중요한 역할을 하는 여러 envelope glycoprotein이 포함되어 있는데(Wittmann and Rziha, 1989), 감염된 숙주의 면역반응을 일으키는 항원으로서 작용하고 있다(Marchioli et al., 1987; Mettenleiter, 1994). 지금까지 10개의 glycoprotein이 확인되었으며, 그 중에서 gC, gE, gG, gI 및 gM은 nonessential glycoprotein으로 바이러스의 복제에 필수적인 glycoprotein은 아니다. 반면에 gB, gD, gH, gK 및 gL는 바이러스의 복제에 필수적인 glycoprotein으로 알려져 있다(Mettenleiter, 1994; Mettenleiter, 1996). PrV gB, gC와 gD는 주요 면역원성 단백질로 in vivo와 in vitro에서 면역반응을 유도하는 항원으로 알려지고 있다(Marchioli et al., 1987, Zuckermann et al., 1990; Kimman, 1992; Hong et al.,2002; Weigel et al., 2003). 서로 다른 접종 경로와 다양한 용량을 응용한 연구에서 PrV gB, gC 및 gD가 돼지에서 방어면역에 관여하는 주 envelope 단백이고(Gerdts et al., 1997; Haagmans et al., 1999), 중화항체가, CTL, lymphoproliferation assay등의 방법을 이용하여 특이 면역반응을 확인한 결과 CD4^(+)Th1-type에 의한 면역반응이 강하게 나타남을 확인하였다(Ho et al., 1998; Hwang et al., 2001; Hong et al., 2002). 강한 면역 반응 유도하기 위하여 GM-CSE와 같은 genetic adjuvant를 이용하여 면역반응을 강화시켰고(Somasundaram et al., 1999; Dufour et al.,2000), 일반적인 DNA 백신의 안전성을 개선하고 면역반응을 증강시키기 위하여 alphavirus-based expression vector를 이용하여 일반적인 플라스미드 DNA 백신과 비교하여 세포성 면역이 증가하고 방어면역능력도 증가하여 백신의 효능이 증가된다고 보고되었다(Dubensky et al., 1996; Berglund et al., 1998; Londstrom,2000; Dufour and Boisseson, 2003; Xiao et al., 2004). 또한, 돼지에서 발병하는 PrV가 마우스, 래트, racoon 및 야생토끼를 포함하는 야생포유류에서 치명적이라는 보고가 있은 후(Field and Hill, 1975; Maes et al., 1979; Kirkpatrick et at., 1980; Thawley and Wright, 1982), 돼지외의 동물모델을 이용하여 PrV에 대한 연구가 진행되어져 왔다(Jakubik, 1977; Bianchi et al., 1998). 화이트 마우스에서 사독백신으로 백신 연구의 가능성을 제시한 이래로(Neukirch and Bauer, 1977) 약독화 백신, 유전자 변형 생 백신(McFarland and Hill, 1987; Takada et al., 1994) 및 DNA 백신(Chang et al., 1998, Garmendia et al., 1998)을 적용하여 PrV백신 연구에 적합한 모델로서 제시되어 왔다. 본 연구의 3장에서는 pCI-neo eukaryotic mammnlina vector에 PrV gB, gC, gD를 각각 재조합하여 만든 플라스미드 DNA 백신 및 이들을 각기 혼합한 cocktail 백신의 면역반응을 C57BL/6(H-2^(b)) 마우스를 실험 모델로 하여 병원성 PrV Yangsan strain에 대한 면역반응과 방어면역에 관하여 조사하였으며, 한국에서 분리한 병원성 PrV Yangsan strain에 대한 면역반응을 관찰하여 우리나라에서 플라스미드 DNA 백신의 응용 가능성과 강한 면역원성을 가지며 방어면역능력을 나타내는 항원으로 작용하는 적합한 glycoprotein에 대하여 조사하였다. 또한, 마우스 모델을 이용하여 병원성 PrV Yangsan strain에 대한 약독화 생백신, 사독 백신, adjuvant가 포함된 subunit 백신 및 glycoprotein을 발현하는 DNA 백신의 면역반응과 방어면역에 관하여 조사하였다.
Pseudorabies virus (PrV) is an alpha-herpesvirus that causes fatal disease in swine called Aujeszky's disease. The clinical feature ranges from inapparent to fatal depending on age and immunological status of animals. Furthermore, PrV has a peculiar property of lifelong latent infection in various n...
Pseudorabies virus (PrV) is an alpha-herpesvirus that causes fatal disease in swine called Aujeszky's disease. The clinical feature ranges from inapparent to fatal depending on age and immunological status of animals. Furthermore, PrV has a peculiar property of lifelong latent infection in various nervous tissues of natural hosts that can reactivate under experimental or natural stresses to release infectious virions into environment. Reactivation of such latent PrV has been thus considered as a major hindrance of eradicaiion program. In the present study, we firstly tried to investigate latent PrV in nervous tissues of seropositive pigs. Secondly, to evaluate influence of vaccine type and administration route on latent infection of PrV, we investigated PrV latency and the nature of protective immunity using murine models immunized with several vaccine types and different administration routes. In the last part, we evaluated the immunity induced by plasmid DNA expressing PrV glycoprotein antigens to analyze the relationship with protective effect following virulent virus challenge. In the first part, the prevalence and quantity of latently infected PrVin nervous tissues of seropositive pigs were investigated. Nervous tissues including trigeminal ganglion (TG), olfactory bulb (OB), and brain stem (BS) were collected from 94 heads of seropositive pigs determined by serological test. The prevalence of nervous tissues latently infected with PrV was then determined by nested PCR targeted three glycoprotein genes (gB, gE, and gG). Latently infected PrVs were variously detected in all three nervous tissues depending on target gene. Thus, most of selected seropositive pigs (95.7％) were latently infected with field PrV in reflection with all positive data of nested PCR. Furthermore, the examination of tissues by real-time PCR analysis revealed to harbor broad copy numbers of latent PrV genome ranged from 10^(7.1) to 10^(0.5) copies per one microgram of genomic DNA. These results indicate that field PrV could be latently present in various nervous tissues and in wide range of quantity under normal condition without apparent clinical signs. In the second part, to investigate the influence of vaccine type and administration route on the latency load of PrV, we immunized mice with three types of vaccine such as attenuated live △TK/□-gal+, Triton X-100 inactivated, and commercially available oil-adjuvant subunit vaccine via either intranasal or intramuscular route. Such immunized mice were intranasally challenged with virulent PrV on 2 weeks post-vaccination. Four weeks after challenge, the latency load of PrV in nervous tissue was determined by real-time PCR along with the nature of protective immunity The intranasal vaccination of attenuated live △TK/□-gal+ vaccine showed the most potent protection against virulent virus challenge and more reduced latent infection in brain than other vaccination protocols. Intranasal vaccination elicited both systemic and mucosal immunity as determined by serum virus-specific IgG and mucosal IgA responses, whereas intramuscular vaccination failed to induce mucosal immunity. furthermore, attenuated live vaccine induced more biased immunity to Th1-type than inactivated vaccine. Thus, these facts imply that the latent infection could be influenced by the nature of immunity induced by vaccine type and administration route. In the last part, as attempt for development of DNA vaccines against PrV infection, the nature of induced immunity was evaluated using murine model injected with plasmid DNA expressing glycoprotein antigens (gB, gC, gD) of PrV. Mice in each group were intramuscularly immunized three times at 7-day intervals. The humoral and cell-mediated immune responses in spleen and draining lymph node were then determined 2 weeks following the last boosting. Plasmid DNA expressing gB mounted the immunity biased to the Th1-type pattern as determined by the ratio of immunoglobulin isotypes(IgG2a and IgG1) and cytokine IFN-γ and IL-4 levels produced by CD4^(+) T cells. In contrast the other glycoprotein antigens gC and gD induced more biased immunity to Th2-type pattern. Interestingly, the cocktail vaccination mixed with all three DNA vaccines elicited the immunity biased to Th2-type than plasmid DNA encoding gB. Such cocktail vaccination showed the most potent protection against virulent PrV infection. The immunization of DNA vaccine expressing gB showed stronger protective immunity than other antigen-encoded DNA vaccines. Consequently glycoprotein B of PrV could become candidate immunogen as an antigen of reliable DNA vaccine, but the cocktail vaccination of three antigen-encoded DNA vaccines could more efficient way of protection against virulent PrV infection.
Pseudorabies virus (PrV) is an alpha-herpesvirus that causes fatal disease in swine called Aujeszky's disease. The clinical feature ranges from inapparent to fatal depending on age and immunological status of animals. Furthermore, PrV has a peculiar property of lifelong latent infection in various nervous tissues of natural hosts that can reactivate under experimental or natural stresses to release infectious virions into environment. Reactivation of such latent PrV has been thus considered as a major hindrance of eradicaiion program. In the present study, we firstly tried to investigate latent PrV in nervous tissues of seropositive pigs. Secondly, to evaluate influence of vaccine type and administration route on latent infection of PrV, we investigated PrV latency and the nature of protective immunity using murine models immunized with several vaccine types and different administration routes. In the last part, we evaluated the immunity induced by plasmid DNA expressing PrV glycoprotein antigens to analyze the relationship with protective effect following virulent virus challenge. In the first part, the prevalence and quantity of latently infected PrVin nervous tissues of seropositive pigs were investigated. Nervous tissues including trigeminal ganglion (TG), olfactory bulb (OB), and brain stem (BS) were collected from 94 heads of seropositive pigs determined by serological test. The prevalence of nervous tissues latently infected with PrV was then determined by nested PCR targeted three glycoprotein genes (gB, gE, and gG). Latently infected PrVs were variously detected in all three nervous tissues depending on target gene. Thus, most of selected seropositive pigs (95.7％) were latently infected with field PrV in reflection with all positive data of nested PCR. Furthermore, the examination of tissues by real-time PCR analysis revealed to harbor broad copy numbers of latent PrV genome ranged from 10^(7.1) to 10^(0.5) copies per one microgram of genomic DNA. These results indicate that field PrV could be latently present in various nervous tissues and in wide range of quantity under normal condition without apparent clinical signs. In the second part, to investigate the influence of vaccine type and administration route on the latency load of PrV, we immunized mice with three types of vaccine such as attenuated live △TK/□-gal+, Triton X-100 inactivated, and commercially available oil-adjuvant subunit vaccine via either intranasal or intramuscular route. Such immunized mice were intranasally challenged with virulent PrV on 2 weeks post-vaccination. Four weeks after challenge, the latency load of PrV in nervous tissue was determined by real-time PCR along with the nature of protective immunity The intranasal vaccination of attenuated live △TK/□-gal+ vaccine showed the most potent protection against virulent virus challenge and more reduced latent infection in brain than other vaccination protocols. Intranasal vaccination elicited both systemic and mucosal immunity as determined by serum virus-specific IgG and mucosal IgA responses, whereas intramuscular vaccination failed to induce mucosal immunity. furthermore, attenuated live vaccine induced more biased immunity to Th1-type than inactivated vaccine. Thus, these facts imply that the latent infection could be influenced by the nature of immunity induced by vaccine type and administration route. In the last part, as attempt for development of DNA vaccines against PrV infection, the nature of induced immunity was evaluated using murine model injected with plasmid DNA expressing glycoprotein antigens (gB, gC, gD) of PrV. Mice in each group were intramuscularly immunized three times at 7-day intervals. The humoral and cell-mediated immune responses in spleen and draining lymph node were then determined 2 weeks following the last boosting. Plasmid DNA expressing gB mounted the immunity biased to the Th1-type pattern as determined by the ratio of immunoglobulin isotypes(IgG2a and IgG1) and cytokine IFN-γ and IL-4 levels produced by CD4^(+) T cells. In contrast the other glycoprotein antigens gC and gD induced more biased immunity to Th2-type pattern. Interestingly, the cocktail vaccination mixed with all three DNA vaccines elicited the immunity biased to Th2-type than plasmid DNA encoding gB. Such cocktail vaccination showed the most potent protection against virulent PrV infection. The immunization of DNA vaccine expressing gB showed stronger protective immunity than other antigen-encoded DNA vaccines. Consequently glycoprotein B of PrV could become candidate immunogen as an antigen of reliable DNA vaccine, but the cocktail vaccination of three antigen-encoded DNA vaccines could more efficient way of protection against virulent PrV infection.
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