황색 포도상구균은 병원 환경이나 생활 주변에서 감염되기 쉬운 균종 중 하나이며, 여러 항생제에 대해 저항성을 일으키며, 특히 β-lactam 계열의 항생제에 대한 내성균의 증가는 전 세계적으로 중요한 문제이며 우리나라도 예외가 아니다. 특히 methicillin에 내성을 일으키는 균주는 치료에 어려움이 많다 한때는 비용이나 시간이 많이 들고 과정이 복잡하였던 분자 생물학적 과학 분야에 PCR의 소개는 매우 신속하고, 정확하며 특이한 유전자 검출 기술이 되었다. 본 실험에서는 PCR 방법을 이용하여 methicillin-resistant 황색 포도상구균(...
황색 포도상구균은 병원 환경이나 생활 주변에서 감염되기 쉬운 균종 중 하나이며, 여러 항생제에 대해 저항성을 일으키며, 특히 β-lactam 계열의 항생제에 대한 내성균의 증가는 전 세계적으로 중요한 문제이며 우리나라도 예외가 아니다. 특히 methicillin에 내성을 일으키는 균주는 치료에 어려움이 많다 한때는 비용이나 시간이 많이 들고 과정이 복잡하였던 분자 생물학적 과학 분야에 PCR의 소개는 매우 신속하고, 정확하며 특이한 유전자 검출 기술이 되었다. 본 실험에서는 PCR 방법을 이용하여 methicillin-resistant 황색 포도상구균(MRSA)으로부터 장독소의 발생, 형별 분포와 유행의 역학적인 측면을 연구하고자 하였으며, 세포 외 독소인 toxic shocksyndrome toxin(TSST-1) gene을 검출하여 염기서열을 비교하였고, MRSA이면서 TSST-1 유전자를 가진 균주의 병원 내 감염 여부를 알아보기 위하여 AP-PCR 과 PFGE 방법을 이용하여 분자 역학적인 측면에서 연구하였다. 항생제 감수성 시험을 실시하여 임상에서 분리된 황색 포도상구균281주 중 MRSA로 분리된 것은 210주로서 74.73%의 높은 검출률을 보였으며, 일본의 경우와는 비슷하지만 미국이나 유럽과 비교하였을 때 훨씬 높은 것으로 밝혀졌다. Methicillin 이외에도 gentamicin, ciprofloxacin 과 β-lactam 계열항생제에 많은 내성을 나타내었다. Multiplex PCR 방법을 이용하여 유전자 분석을 한 결과 황색 포도상구균의 형특이 유전 물질인 nuc gene은 사용된 MRSA균주의 100%에서 발견되었고, MRSA의 가장 중요한 유전적 물질이라고 여겨지는 mech gene은 사용된 MRSA균주의 99%에서 발견되었다. 또한 multiplex PCR을 이용한 장독소 유전자의 양상은 우리나라에서 황색 포도상구균 장독소의 가장 많은 유행형은 enterotoxin A(17.2%)이고 그 다음은 enterotoxin C(11.9%), enterotoxin D(9.5%)와 enterotoxin B(1.4%)의 순이었다. Enterotoxin E는 사용된 모든 균주로부터 검출되지 않았다. 따라서 enterotoxin A가 세계적으로 널리 유행하는 형임이 증명되었다. 그러나 다른 장독소의 분포와 빈도는 지역에 따라 달랐으며, 유럽에서는 enterotoxin B가 두 번째로 많이 유행하는 형임에 반해 우리나라에서는 enterotoxin C가 많이 유행하였다. MRSA증 12.4%에 해당하는 26 균주가 toxic shock synone toxingenes(tst)을 가지고 있었으며, 그중 24균주(92.3%)가 하나 또는 두개의 enterotoxin과 함께 검출되었다. 그리고 둘 또는 그 이상의 독소와 결합하여 여러 독소를 생성하는 균의 발생률은 34.3%가 되었다. TSST-1(tst) 유전자의 염기 서열을 비교 분석한 결과 gene bank에 맞혀진 균주 U93688과 비교하였을 때 305 염기부위만 달라 99%의 상 동성이 있는 것으로 나타났다. 현재 국내에서는 포도상구균 균주의 typing은 antibiogram과 biotyping에 의존하는 정도이며 PCR에 기초한 포도상구균의 형 분류에 관한 보고, 특히 AP-PCR(Arbitrarily Primed-PCR)에 기초한 연구보고는 없다. 또한 AP-PCR의 해석에 있어서도 아직 표준화된 지침이 설정되어 있지 않다. TSST-1 생성 MRSA 26균주를 AP-PCR에 의해 분석한 결과 26개의 균주 모두를 전기 영동한 결과에서 primer S_(1)은 21번 균주를 제외하고는 25개 균주가 90%이상의 유사성을 보였으며, 2개의 군(group)과 2개의 아군(subgroup)으로 분류되었다. Primer S_(2)는 20개의 균주가 90% 이상의 유사성을 보였으며, 2개의 군과 2개의 아군으로 나뉘어졌다. Primer E2에서는 90% 이상이 21개 균주였으며 2개의 군과 6개의 아군으로 분류되었다. 이상 primer S_(1), S_(2), E_(2)를 모두 조합하였을 때 전체 26균주 중 84.62%가 유전적으로 연관성이 높은 것으로 나타났다. 또한 같은 병원에서 분리된 균주는 거의 같은 subgroup에 속하는 것으로 보아 병원 내 유행 균주가 병원마다 다름을 알 수 있었다 또한 AP-PCR은 임의의 primer를 사용하여 증폭된 절편들의 크기와 수에 있어서 육안적으로도 분석하기가 매우 용이하였고 DNA 추출과정, BNA 증폭과정 및 전기영동에서 결과 판독까지 약 10시간으로 충분하였으며 과정 역시 간편하면서도 해석의 용이성, 분별력 높은 결과를 얻을 수 있었다. TSST-1 생성 MRSA의 comosomal DNA를 Smal 제한효소 처리하여 PFGE(Pulsed-field gel electrophoresis)한 결과 47%에서 하나의 pattern으로 묶여졌으며, 7 subtype으로 나뉘었다. TSST-1 생성 균주 26주 중 20균주가 denogram에서 70%에서 하나로 묶여지는 유사성 을 보여주었다. 동일한 band를 보이는 균주를 병원 내 감염 균주로 추정하였고, 각 병원바다 병원 내 감염 유행 균주가 다름을 알 수 있었다. 본 실험에서 AP-PCR은 Dice coefficient에 따라 분류되었을 때 90% 이상의 유사성을 나타내는 균주가 20개 이상이었으나 PFGE 에서는 10개 균주 만이 90% 이상에서 유사성을 보였고 70% 정도에서 20개 균주가 유사성을 보이는 것으로 보아 PFGE 방법이 AP-PCR보다 더욱 예민하고 정확한 방법이라고 사료된다. 또한 같은 병원 내에서 유행하는 균주는 PFGE 방법과 AP-PCR로 분석하였을 때 동일한 pattern을 보여 주는 것으로 보아 두 방법 간에 상관성이 높음을 알 수 있었다. 따라서 앞으로 병원 내 감염 균주의 관리를 위하여는 AP-PCR, PFGE 등 두 가지 이상의 분자 생물학적인 방법을 함께 이용한 분석방법을 통하여 유전자 검출 및 역학조사가 이루어져야 할 것으로 사료된다.
황색 포도상구균은 병원 환경이나 생활 주변에서 감염되기 쉬운 균종 중 하나이며, 여러 항생제에 대해 저항성을 일으키며, 특히 β-lactam 계열의 항생제에 대한 내성균의 증가는 전 세계적으로 중요한 문제이며 우리나라도 예외가 아니다. 특히 methicillin에 내성을 일으키는 균주는 치료에 어려움이 많다 한때는 비용이나 시간이 많이 들고 과정이 복잡하였던 분자 생물학적 과학 분야에 PCR의 소개는 매우 신속하고, 정확하며 특이한 유전자 검출 기술이 되었다. 본 실험에서는 PCR 방법을 이용하여 methicillin-resistant 황색 포도상구균(MRSA)으로부터 장독소의 발생, 형별 분포와 유행의 역학적인 측면을 연구하고자 하였으며, 세포 외 독소인 toxic shock syndrome toxin(TSST-1) gene을 검출하여 염기서열을 비교하였고, MRSA이면서 TSST-1 유전자를 가진 균주의 병원 내 감염 여부를 알아보기 위하여 AP-PCR 과 PFGE 방법을 이용하여 분자 역학적인 측면에서 연구하였다. 항생제 감수성 시험을 실시하여 임상에서 분리된 황색 포도상구균281주 중 MRSA로 분리된 것은 210주로서 74.73%의 높은 검출률을 보였으며, 일본의 경우와는 비슷하지만 미국이나 유럽과 비교하였을 때 훨씬 높은 것으로 밝혀졌다. Methicillin 이외에도 gentamicin, ciprofloxacin 과 β-lactam 계열항생제에 많은 내성을 나타내었다. Multiplex PCR 방법을 이용하여 유전자 분석을 한 결과 황색 포도상구균의 형특이 유전 물질인 nuc gene은 사용된 MRSA균주의 100%에서 발견되었고, MRSA의 가장 중요한 유전적 물질이라고 여겨지는 mech gene은 사용된 MRSA균주의 99%에서 발견되었다. 또한 multiplex PCR을 이용한 장독소 유전자의 양상은 우리나라에서 황색 포도상구균 장독소의 가장 많은 유행형은 enterotoxin A(17.2%)이고 그 다음은 enterotoxin C(11.9%), enterotoxin D(9.5%)와 enterotoxin B(1.4%)의 순이었다. Enterotoxin E는 사용된 모든 균주로부터 검출되지 않았다. 따라서 enterotoxin A가 세계적으로 널리 유행하는 형임이 증명되었다. 그러나 다른 장독소의 분포와 빈도는 지역에 따라 달랐으며, 유럽에서는 enterotoxin B가 두 번째로 많이 유행하는 형임에 반해 우리나라에서는 enterotoxin C가 많이 유행하였다. MRSA증 12.4%에 해당하는 26 균주가 toxic shock synone toxingenes(tst)을 가지고 있었으며, 그중 24균주(92.3%)가 하나 또는 두개의 enterotoxin과 함께 검출되었다. 그리고 둘 또는 그 이상의 독소와 결합하여 여러 독소를 생성하는 균의 발생률은 34.3%가 되었다. TSST-1(tst) 유전자의 염기 서열을 비교 분석한 결과 gene bank에 맞혀진 균주 U93688과 비교하였을 때 305 염기부위만 달라 99%의 상 동성이 있는 것으로 나타났다. 현재 국내에서는 포도상구균 균주의 typing은 antibiogram과 biotyping에 의존하는 정도이며 PCR에 기초한 포도상구균의 형 분류에 관한 보고, 특히 AP-PCR(Arbitrarily Primed-PCR)에 기초한 연구보고는 없다. 또한 AP-PCR의 해석에 있어서도 아직 표준화된 지침이 설정되어 있지 않다. TSST-1 생성 MRSA 26균주를 AP-PCR에 의해 분석한 결과 26개의 균주 모두를 전기 영동한 결과에서 primer S_(1)은 21번 균주를 제외하고는 25개 균주가 90%이상의 유사성을 보였으며, 2개의 군(group)과 2개의 아군(subgroup)으로 분류되었다. Primer S_(2)는 20개의 균주가 90% 이상의 유사성을 보였으며, 2개의 군과 2개의 아군으로 나뉘어졌다. Primer E2에서는 90% 이상이 21개 균주였으며 2개의 군과 6개의 아군으로 분류되었다. 이상 primer S_(1), S_(2), E_(2)를 모두 조합하였을 때 전체 26균주 중 84.62%가 유전적으로 연관성이 높은 것으로 나타났다. 또한 같은 병원에서 분리된 균주는 거의 같은 subgroup에 속하는 것으로 보아 병원 내 유행 균주가 병원마다 다름을 알 수 있었다 또한 AP-PCR은 임의의 primer를 사용하여 증폭된 절편들의 크기와 수에 있어서 육안적으로도 분석하기가 매우 용이하였고 DNA 추출과정, BNA 증폭과정 및 전기영동에서 결과 판독까지 약 10시간으로 충분하였으며 과정 역시 간편하면서도 해석의 용이성, 분별력 높은 결과를 얻을 수 있었다. TSST-1 생성 MRSA의 comosomal DNA를 Smal 제한효소 처리하여 PFGE(Pulsed-field gel electrophoresis)한 결과 47%에서 하나의 pattern으로 묶여졌으며, 7 subtype으로 나뉘었다. TSST-1 생성 균주 26주 중 20균주가 denogram에서 70%에서 하나로 묶여지는 유사성 을 보여주었다. 동일한 band를 보이는 균주를 병원 내 감염 균주로 추정하였고, 각 병원바다 병원 내 감염 유행 균주가 다름을 알 수 있었다. 본 실험에서 AP-PCR은 Dice coefficient에 따라 분류되었을 때 90% 이상의 유사성을 나타내는 균주가 20개 이상이었으나 PFGE 에서는 10개 균주 만이 90% 이상에서 유사성을 보였고 70% 정도에서 20개 균주가 유사성을 보이는 것으로 보아 PFGE 방법이 AP-PCR보다 더욱 예민하고 정확한 방법이라고 사료된다. 또한 같은 병원 내에서 유행하는 균주는 PFGE 방법과 AP-PCR로 분석하였을 때 동일한 pattern을 보여 주는 것으로 보아 두 방법 간에 상관성이 높음을 알 수 있었다. 따라서 앞으로 병원 내 감염 균주의 관리를 위하여는 AP-PCR, PFGE 등 두 가지 이상의 분자 생물학적인 방법을 함께 이용한 분석방법을 통하여 유전자 검출 및 역학조사가 이루어져야 할 것으로 사료된다.
Staphylococcus aureus is one of the most significant pathogens and a causative agent of nosocomial infections. The emergence of methicillin-resistant S. aureus(MRSA), in particular, has become a major clinical and epidemiological problems worldwide. Staphylococcus aureus produces extracellular toxin...
Staphylococcus aureus is one of the most significant pathogens and a causative agent of nosocomial infections. The emergence of methicillin-resistant S. aureus(MRSA), in particular, has become a major clinical and epidemiological problems worldwide. Staphylococcus aureus produces extracellular toxins like enterotoxins, exfoliative toxin and toxic shock syndrome toxin (TSST-1), and virulence factors that thought to be contributing to the pathogenicity of the microorganism. To monitor and prevent the intra-and interhospital spread of MRSA, efficient and accurate epidemiologic typing systems are necessary. Among 281 strains of S. aureus isolated from clinical specimens, 210 strains were identified as MRSA(74.73%). The study attempted to detect genes of nuc, mecA, enterotoxin A to E and TSST-1(tst) in baterial lysates extracted from human strains of S. aureus by multiplex PCR method. In 210 isolates of MRSA, all strains showed both nuc and mecA genes except that two strains expressed only nuc gene. Staphylococcal food poisoning, caused by enterotoxin-producing S. aureus, is a common type of food-borne infection in many countries. Toxic shock syndrome(TSS) is a specific type of infectious disease occurring widely in young women during their menstrual period, but it has also been reported lately from individuals not involved with the period including male patients. Bacteriologically, toxic shock sysdrome is closely associated with strains of S. aureus carrying the tst genes encoding toxic shock syndrome toxin 1(TSST-1) 169(80.5%) of 210 MRSA isolates tested produced one or more toxins while other 41(19.5%) isolates produced no toxins. Types of genes amplified were enterotoxin A(eta), enterotoxin B(etb), enterotoxin C(etc), enterotoxin D(etd) and 7557-1(tst) in 50.5%(105), 14.3%(30), 23.3%(49), 10.0%(21) and 12.4%(26) from the isolates, respectively. 58(27.6%) strains revealed more than two enteroxin genes. The most common combination of toxin genes was eta with etb which was found in 26(12.4%) strains, and the next frequent combination was etc with 1st in 14(6.7%) strains from 210 isolates in Korea. Apparent differences in enterotoxin type distributions were also found among the countries. Beside enterotoxin A which was most predominantely found in both European countries and Korea, enterotoxln C was the subsequently prevalent type of toxin in Korea rather than enterotoxin B which was found as the second most prevalent enterotoxin in some European countries. The identification of Staphylococcal toxin genes in strains of S. aureus by the PCR, which is considered to be the most advanced methodology for gene detection in its reliability and sensitivity, was proved to be a more specific, sensitive, relatively rapid and inexpensive method than conventional immunological assays. The result of BNA sequence analysis of TSST-1(1st) gene revealed that the 99%(349/350) of the test agreed with that of U93688 type strain showing only one gene dismatching, g-a at 305 which is supposed to be a-a. When chromosomal DNA of TSST-1 positive MRSAS that had been pre-treated with SmaI enzyme were applied to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and subsquentely drawn on the dendrograms with the aid of PC Fingerprinting Software, all of the 26 strains were grouped in sme banding patterns with 7 different subtypes based on the discriminatory power. As far as gene similarity of the strains done by the dice coefficient patterns showed, the average discriminatory index by PFGE was 0.70. And 20 out of 26 strains drawn on the dendrogram fell into a single cluster, which means 20strains are considered to be "indistinguishable" to "closely related" groups, at its similarity showing 70%. As PFGE has been lately used as an epidemiological typing method for S. aureus, the method was proved to have advantages in discriminatory power, typeability, and reproducibility over AP-PCR in differentiation of toxin producing strains when combined with the software aided dendrograms which make them enable to classify the epidemiologically related strains in much more details. The study also revealed in comparison of the outcomes between AP-PCR and PFGE that some strains showed constant PFGE band patterns while remarkable vanations shown by AP-PCR. The discrepancy between the methods suggests that the combined analysis with both methods would yield far more accurate discriminatory power in distinguishing epidewuologically related strains from unrelated strains. However, it can be evaluated that both AP-PCR and PFGE are well related each other in performance because the results shown by the strains isolated from a hospital revealed almost identical patterns by both methods which indicates that the confined strains in a hospital are closely correlated in the aspect of epidemiology. Although PFGE has proved superior in discriminatory power, universal strain typing ability, and reproducibility over AP-PCR, it was recommended that the combined use of both methods would provide more detailed and satisfactory information in epidemiologic investigation of bacterial strains of nosocomial interest.
Staphylococcus aureus is one of the most significant pathogens and a causative agent of nosocomial infections. The emergence of methicillin-resistant S. aureus(MRSA), in particular, has become a major clinical and epidemiological problems worldwide. Staphylococcus aureus produces extracellular toxins like enterotoxins, exfoliative toxin and toxic shock syndrome toxin (TSST-1), and virulence factors that thought to be contributing to the pathogenicity of the microorganism. To monitor and prevent the intra-and interhospital spread of MRSA, efficient and accurate epidemiologic typing systems are necessary. Among 281 strains of S. aureus isolated from clinical specimens, 210 strains were identified as MRSA(74.73%). The study attempted to detect genes of nuc, mecA, enterotoxin A to E and TSST-1(tst) in baterial lysates extracted from human strains of S. aureus by multiplex PCR method. In 210 isolates of MRSA, all strains showed both nuc and mecA genes except that two strains expressed only nuc gene. Staphylococcal food poisoning, caused by enterotoxin-producing S. aureus, is a common type of food-borne infection in many countries. Toxic shock syndrome(TSS) is a specific type of infectious disease occurring widely in young women during their menstrual period, but it has also been reported lately from individuals not involved with the period including male patients. Bacteriologically, toxic shock sysdrome is closely associated with strains of S. aureus carrying the tst genes encoding toxic shock syndrome toxin 1(TSST-1) 169(80.5%) of 210 MRSA isolates tested produced one or more toxins while other 41(19.5%) isolates produced no toxins. Types of genes amplified were enterotoxin A(eta), enterotoxin B(etb), enterotoxin C(etc), enterotoxin D(etd) and 7557-1(tst) in 50.5%(105), 14.3%(30), 23.3%(49), 10.0%(21) and 12.4%(26) from the isolates, respectively. 58(27.6%) strains revealed more than two enteroxin genes. The most common combination of toxin genes was eta with etb which was found in 26(12.4%) strains, and the next frequent combination was etc with 1st in 14(6.7%) strains from 210 isolates in Korea. Apparent differences in enterotoxin type distributions were also found among the countries. Beside enterotoxin A which was most predominantely found in both European countries and Korea, enterotoxln C was the subsequently prevalent type of toxin in Korea rather than enterotoxin B which was found as the second most prevalent enterotoxin in some European countries. The identification of Staphylococcal toxin genes in strains of S. aureus by the PCR, which is considered to be the most advanced methodology for gene detection in its reliability and sensitivity, was proved to be a more specific, sensitive, relatively rapid and inexpensive method than conventional immunological assays. The result of BNA sequence analysis of TSST-1(1st) gene revealed that the 99%(349/350) of the test agreed with that of U93688 type strain showing only one gene dismatching, g-a at 305 which is supposed to be a-a. When chromosomal DNA of TSST-1 positive MRSAS that had been pre-treated with SmaI enzyme were applied to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and subsquentely drawn on the dendrograms with the aid of PC Fingerprinting Software, all of the 26 strains were grouped in sme banding patterns with 7 different subtypes based on the discriminatory power. As far as gene similarity of the strains done by the dice coefficient patterns showed, the average discriminatory index by PFGE was 0.70. And 20 out of 26 strains drawn on the dendrogram fell into a single cluster, which means 20strains are considered to be "indistinguishable" to "closely related" groups, at its similarity showing 70%. As PFGE has been lately used as an epidemiological typing method for S. aureus, the method was proved to have advantages in discriminatory power, typeability, and reproducibility over AP-PCR in differentiation of toxin producing strains when combined with the software aided dendrograms which make them enable to classify the epidemiologically related strains in much more details. The study also revealed in comparison of the outcomes between AP-PCR and PFGE that some strains showed constant PFGE band patterns while remarkable vanations shown by AP-PCR. The discrepancy between the methods suggests that the combined analysis with both methods would yield far more accurate discriminatory power in distinguishing epidewuologically related strains from unrelated strains. However, it can be evaluated that both AP-PCR and PFGE are well related each other in performance because the results shown by the strains isolated from a hospital revealed almost identical patterns by both methods which indicates that the confined strains in a hospital are closely correlated in the aspect of epidemiology. Although PFGE has proved superior in discriminatory power, universal strain typing ability, and reproducibility over AP-PCR, it was recommended that the combined use of both methods would provide more detailed and satisfactory information in epidemiologic investigation of bacterial strains of nosocomial interest.
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