재래산양은 우리나라 고유의 재래가축으로 다른 축종에 비해 아직까지 고유의 특성을 지니고 있는데, 성격이 온순하고 환경에 대한 적응력이 뛰어나므로 오래전부터 농가에서 많이 길러오고 있다. 또한 재래산양은 우리나라 고유의 품종이라는 측면과 다른 경제동물에 비해 체구가 작고, 외부환경에 대한 적응력이 뛰어나며, 번식력이 좋고, 임신기간이 짧은 장점을 가지고 있어 생명공학이나 형질전환 동물의 생산과 같은 학문연구의 실험용 동물로 많이 이용되고 있다. 지금까지 우리나라의 재래가축 중 한우를 제외하고는 생식세포로의 동결보존에 대한 연구가 미진한 형편인데 이는 경제적인 가치로 재래산양이 한우에 비해 열세하므로 기술개발이 부진한 것으로 예측된다. 그러므로 오랜세월 우리민족과 함께 해온 재래 재래산양의 이용효율을 극대화시키고 유전자원의 보존을 위한 연구가 시급하다 하겠다. 생식세포로서 정액 및 수정란의 생산과 동결보존기술 개발을 위한 연구는 산업적 효과가 크고, 번식효율을 높이고, 재래산양의 개량과 유전자원보존기술의 개발을 높이기 위해 활발히 연구되어져야 할 것이다. 가축의 인공수정은 급속한 발달을 이루어 최근에는 동결정액의 개발로 소의 경우는 인공수정의 실시가 보편화 되었다. 그러나 산양의 인공수정보급률은 세계적으로도 아직 10% 미만이고 우리나라에서는 재래산양의 인공수정에 관한 연구는 거의 없는 실정이다. 산양에서의 체내수정란은 공란축에게 인위적으로 발정을 유기하는 발정동기화, 다수의 난자를 성숙·배란시키는 과배란처리와 같은 호르몬처리를 통하여 다수의 난자가 배란되게하여 정액으로 수정시킨후 착상전에 자궁에서 수정란을 회수하는 방법이며, 체외수정란은 도축되는 가축난소로부터 난자를 회수하여 난자와 정자를 체외에서 처리한 다음 배양기내에서 양자를 수정시켜 수정란을 생산하는 방법으로 난포란의 체외성숙, 체외수정, 체외배양의 기술들로 나뉘어지며 동물종에 따라 그 기술은 다소의 차이가 있다. 수정란의 장기보존을 위해서는 동결보존기술이 뒤따라야 하는데 포유동물의 수정란동결은 보편적으로 이용되고 있으며, 동결보존된 수정란으로부터 많은 종류의 산자가 생산되고 있다. ...
재래산양은 우리나라 고유의 재래가축으로 다른 축종에 비해 아직까지 고유의 특성을 지니고 있는데, 성격이 온순하고 환경에 대한 적응력이 뛰어나므로 오래전부터 농가에서 많이 길러오고 있다. 또한 재래산양은 우리나라 고유의 품종이라는 측면과 다른 경제동물에 비해 체구가 작고, 외부환경에 대한 적응력이 뛰어나며, 번식력이 좋고, 임신기간이 짧은 장점을 가지고 있어 생명공학이나 형질전환 동물의 생산과 같은 학문연구의 실험용 동물로 많이 이용되고 있다. 지금까지 우리나라의 재래가축 중 한우를 제외하고는 생식세포로의 동결보존에 대한 연구가 미진한 형편인데 이는 경제적인 가치로 재래산양이 한우에 비해 열세하므로 기술개발이 부진한 것으로 예측된다. 그러므로 오랜세월 우리민족과 함께 해온 재래 재래산양의 이용효율을 극대화시키고 유전자원의 보존을 위한 연구가 시급하다 하겠다. 생식세포로서 정액 및 수정란의 생산과 동결보존기술 개발을 위한 연구는 산업적 효과가 크고, 번식효율을 높이고, 재래산양의 개량과 유전자원보존기술의 개발을 높이기 위해 활발히 연구되어져야 할 것이다. 가축의 인공수정은 급속한 발달을 이루어 최근에는 동결정액의 개발로 소의 경우는 인공수정의 실시가 보편화 되었다. 그러나 산양의 인공수정보급률은 세계적으로도 아직 10% 미만이고 우리나라에서는 재래산양의 인공수정에 관한 연구는 거의 없는 실정이다. 산양에서의 체내수정란은 공란축에게 인위적으로 발정을 유기하는 발정동기화, 다수의 난자를 성숙·배란시키는 과배란처리와 같은 호르몬처리를 통하여 다수의 난자가 배란되게하여 정액으로 수정시킨후 착상전에 자궁에서 수정란을 회수하는 방법이며, 체외수정란은 도축되는 가축난소로부터 난자를 회수하여 난자와 정자를 체외에서 처리한 다음 배양기내에서 양자를 수정시켜 수정란을 생산하는 방법으로 난포란의 체외성숙, 체외수정, 체외배양의 기술들로 나뉘어지며 동물종에 따라 그 기술은 다소의 차이가 있다. 수정란의 장기보존을 위해서는 동결보존기술이 뒤따라야 하는데 포유동물의 수정란동결은 보편적으로 이용되고 있으며, 동결보존된 수정란으로부터 많은 종류의 산자가 생산되고 있다. 포유동물 수정란의 동결보존연구는 1972년 Whittingham 등이 동결보존된 생쥐 수정란을 이식하여 첫 산자를 생산한 이래 활발히 수행되어 왔다. 이에 본 연구는 우리나라 고유의 유전자원인 재래산양의 정액 및 수정란 생산기술을 확립하고 이를 이용한 동결보존기술을 개발하여 정액 및 수정란의 효율적인 생산체계를 마련하며 멸실위험에 처해있는 재래산양의 유전자원보존을 위한 대처방안을 마련하고자 수행하였다. ○재래산양 정액의 일반성상과 동결보존에 관한 연구결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 정액량은 봄, 여름, 가을이 2.2, 2.1, 2.1ml로서 겨울의 1.4ml보다 많이 채취되었으며, 정자농도와 총정자수도 겨울이 17.3과 23.6×10^(8)/ml로서 봄 24.3과 53.6×10^(8)/ml, 여름 23.9와 50.9,×10^(8)/ml, 가을 21.8과 44.7×10^(8)/ml에 비하여 낮게 나타났다. 정자의 생존성은 년중 85%이상의 생존율을 나타내었고, 운동성은 봄철이 다른 계절에 비해 활발하지 않은 것으로 나타내었다. 정액의 pH는 모두 7.0부근의 중성을 나타내었는데, 봄과 여름은 7.1, 가을 6.8, 겨울 6.9를 나타내었다. 2. Tris-egg yolk-glycerol을 기본희석제로 사용하였을 경우 동결·융해후 생존율이 70%를 나타낸 반면 Tris-egg yolk-glycerol에 lactose를 각각 60mM, 120mM, 180mM첨가하였을 경우 생존율이 64.3%, 67.6%, 70.4%를 나타내어 lactose를 180mM첨가하였을 경우만 첨가하지 않았을 때와 유사한 수치를 나타내어 lactose의 첨가가 동결시의 생존성에 좋은 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 3. 정액희석제로 희석시까지는 정장을 제거하지 않더라도 생존성에 큰 영향을 미치지 않았으나 5℃에서 평형후에는 정장을 제거하지 않은 경우 대부분의 정자가 사멸하였다. 이에 따른 영향으로 정장제거 정액의 경우 동결·융해 이후 56%의 생존율을 보였으나 정장을 제거하지 않았을 경우 대부분의 정자는 사멸하였다. 4. 난황을 5%, 10% 및 20%의 농도로 첨가하였을 때 각 농도별 생존율은 50%, 41%, 54%로서 난황의 정액희석제내 20%첨가시 가장 좋은 성적을 보였다. 이는 앞에서 조사된 바와 같이 정액내 정장의 제거로 인해 난황응고현상과 정장내 효소의 영향이 제거된 것과 관련이 있을 것이다. 5. 평형시간별 동결·융해후 생존율이 1시간 25%, 1.5시간 42.5%, 2시간 54.2%, 2.5시간 51.7%를 나타내어 평형시간을 2시간으로 하였을 경우 가장 높은 생존율이 높으며 2.5시간 평형시켰을 경우에도 1시간이나 1.5시간에 비해 다소 높은 경향을 나타내었다. 6.간이동결의 경우 70%의 생존율을 나타낸 반면, 완만동결은 45%의 생존율을 나타내어 간이동결에 비해 동결방법이 복잡하고 고가의 세포동결기가 필요함에도 불구하고 동결융해후 생존성이 떨어짐을 알 수 있다. 7.CIDR+PGF_(2)α와 CIDR+PMSG 두처리구에서 CIDR삽입 후 progesterone농도가 상승하여 제거 당일까지 높은 수준의 progesterone의 혈중 농도를 유지하였다. 그러나 CIDR를 제거하면 다음날 바로 그 농도가 1ng/ml 이하 수준으로 떨어졌다. 8.CIDR+PGF_(2)α를 사용하였을 경우 신선정액에서 25%(2/8), 동결정액에서 20%(2/10)의 분만율을 나타내었다. 반면 CIDR+PMSG를 발정동기화 방법으로 사용하였을 경우 10두의 인공수정축에서 분만까지 도달하지는 못하였다. ○재래산양에서 체내수정란 및 이의 동결보존기술 및 체외수정란 생산에 관한 연구결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 발정동기화 및 과배란 처리를 위해 CIDR+FSH 및 CIDR+PMSG의 방법을 이용한 결과, 배란점 및 회수수정란의 수가 CIDR+FSH 처리구에서 16.3개 및 9.4개, CIDR+PMSG 처리구에서 16.4개 및 8.7개를 나타내어 두처리구간에 차이를 나타내지 않았다. 2. 회수한 수정란을 형태학적으로 평가한 결과 CIDR+FSH 처리구에서 A급 75.8%, B급 15.2%, C급 4.5%, D급 4.5%를 나타낸 반면 CIDR+PMSG 처리구에서는 A급 52.5%, B급 16.4%, C급 16.4%, D급 14.8%를 나타내어 회수된 수정란의 등급에서는 CIDR+FSH 처리구가 좋은 효과를 나타내었다. 3. 회수된 수정란을 완만동결법으로 처리구간 동결·융해를 실시하여, CIDR+FSH 처리구에서 73.3%, CIDR+PMSG 처리구에서 63.3%의 발달률을 나타내어 과배란처리방법에 따른 발달률의 뚜렷한 차이를 나타내지는 않았다. 그러나 초자화동결(vitrification)에서는 33.3%의 배발달률을 나타내어 완만동결이 초자화동결보다는 발달률이 좋은 것으로 조사되었다. 4. 흡입법(aspiration)과 세절법(slicing)에 의해 난소 한개당 회수된 난자의 수는 3.9개와 4.1개를 나타내어 slicing 방법이 aspiration 방법보다는 많은 숫자의 난자를 회수하였으나 유의적인 차이는 나타내지 않았다. 5. 회수된 난자의 등급별 분포는 aspiration법에서 Grade Ⅰ, Grade Ⅱ, Grade Ⅲ, Grade Ⅳ의 비율이 10.3%, 20.5%, 38.5%, 30.8%를 나타내었으며, slicing법에서 9.8%, 22.0%, 39.0%, 29.3%를 나타내어 Grade Ⅲ와 Grade Ⅳ의 비율이 70%이상을 차지하였다. 6. 회수된 난자를 체외성숙 시킨결과 난자의 질이 좋은 Grade Ⅰ과 Grade Ⅱ에서는 85% 이상이 methphase Ⅱ (MⅡ)까지 도달하였으나, 난자의 질이 떨어지는 Grade Ⅲ와 Grade Ⅳ 40%이하의 체외성숙율을 나타내었다. 7. 체외수정용 배양액으로 BO를 사용하였을 경우 회수난자의 질이 좋은 GⅠ 및 GⅡ에서 84.8%의 난분할율을 나타내어 TALP를 사용하였을 때의 58.8%보다 높은 난분할율을 나타내었다. 그러나 회수난자의 등급이 좋지않을 경우 수정란으로의 난분할율이 현저히 떨어지는 것으로 나타났다. 8. 체외배양액의 종류를 달리하였을 때 상실배기(morula) 및 포배기 (blastocyst)로의 발달을 M199 배양액에서는 이루지 못하였으나 mSOF를 배양액으로 이용하였을 경우 15.0%의 발달률을 나타내었으며 체외배양시 항산화물질인 glutathione (GSH)을 첨가함으로서 26.8%의 상실배 및 배반포배로의 발달률을 나타내었다. 이상의 결과는 재래산양 정액의 일반성상을 정립하고 이를 동결보존하며, 이와 더불어 수정란의 생산 및 이의 동결보존을 실시하므로서 우리나라 고유의 가축인 재래산양의 유전자원을 영구히 보존하는 기반이 마련될 수 있을 것으로 사료된다.
재래산양은 우리나라 고유의 재래가축으로 다른 축종에 비해 아직까지 고유의 특성을 지니고 있는데, 성격이 온순하고 환경에 대한 적응력이 뛰어나므로 오래전부터 농가에서 많이 길러오고 있다. 또한 재래산양은 우리나라 고유의 품종이라는 측면과 다른 경제동물에 비해 체구가 작고, 외부환경에 대한 적응력이 뛰어나며, 번식력이 좋고, 임신기간이 짧은 장점을 가지고 있어 생명공학이나 형질전환 동물의 생산과 같은 학문연구의 실험용 동물로 많이 이용되고 있다. 지금까지 우리나라의 재래가축 중 한우를 제외하고는 생식세포로의 동결보존에 대한 연구가 미진한 형편인데 이는 경제적인 가치로 재래산양이 한우에 비해 열세하므로 기술개발이 부진한 것으로 예측된다. 그러므로 오랜세월 우리민족과 함께 해온 재래 재래산양의 이용효율을 극대화시키고 유전자원의 보존을 위한 연구가 시급하다 하겠다. 생식세포로서 정액 및 수정란의 생산과 동결보존기술 개발을 위한 연구는 산업적 효과가 크고, 번식효율을 높이고, 재래산양의 개량과 유전자원보존기술의 개발을 높이기 위해 활발히 연구되어져야 할 것이다. 가축의 인공수정은 급속한 발달을 이루어 최근에는 동결정액의 개발로 소의 경우는 인공수정의 실시가 보편화 되었다. 그러나 산양의 인공수정보급률은 세계적으로도 아직 10% 미만이고 우리나라에서는 재래산양의 인공수정에 관한 연구는 거의 없는 실정이다. 산양에서의 체내수정란은 공란축에게 인위적으로 발정을 유기하는 발정동기화, 다수의 난자를 성숙·배란시키는 과배란처리와 같은 호르몬처리를 통하여 다수의 난자가 배란되게하여 정액으로 수정시킨후 착상전에 자궁에서 수정란을 회수하는 방법이며, 체외수정란은 도축되는 가축난소로부터 난자를 회수하여 난자와 정자를 체외에서 처리한 다음 배양기내에서 양자를 수정시켜 수정란을 생산하는 방법으로 난포란의 체외성숙, 체외수정, 체외배양의 기술들로 나뉘어지며 동물종에 따라 그 기술은 다소의 차이가 있다. 수정란의 장기보존을 위해서는 동결보존기술이 뒤따라야 하는데 포유동물의 수정란동결은 보편적으로 이용되고 있으며, 동결보존된 수정란으로부터 많은 종류의 산자가 생산되고 있다. 포유동물 수정란의 동결보존연구는 1972년 Whittingham 등이 동결보존된 생쥐 수정란을 이식하여 첫 산자를 생산한 이래 활발히 수행되어 왔다. 이에 본 연구는 우리나라 고유의 유전자원인 재래산양의 정액 및 수정란 생산기술을 확립하고 이를 이용한 동결보존기술을 개발하여 정액 및 수정란의 효율적인 생산체계를 마련하며 멸실위험에 처해있는 재래산양의 유전자원보존을 위한 대처방안을 마련하고자 수행하였다. ○재래산양 정액의 일반성상과 동결보존에 관한 연구결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 정액량은 봄, 여름, 가을이 2.2, 2.1, 2.1ml로서 겨울의 1.4ml보다 많이 채취되었으며, 정자농도와 총정자수도 겨울이 17.3과 23.6×10^(8)/ml로서 봄 24.3과 53.6×10^(8)/ml, 여름 23.9와 50.9,×10^(8)/ml, 가을 21.8과 44.7×10^(8)/ml에 비하여 낮게 나타났다. 정자의 생존성은 년중 85%이상의 생존율을 나타내었고, 운동성은 봄철이 다른 계절에 비해 활발하지 않은 것으로 나타내었다. 정액의 pH는 모두 7.0부근의 중성을 나타내었는데, 봄과 여름은 7.1, 가을 6.8, 겨울 6.9를 나타내었다. 2. Tris-egg yolk-glycerol을 기본희석제로 사용하였을 경우 동결·융해후 생존율이 70%를 나타낸 반면 Tris-egg yolk-glycerol에 lactose를 각각 60mM, 120mM, 180mM첨가하였을 경우 생존율이 64.3%, 67.6%, 70.4%를 나타내어 lactose를 180mM첨가하였을 경우만 첨가하지 않았을 때와 유사한 수치를 나타내어 lactose의 첨가가 동결시의 생존성에 좋은 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 3. 정액희석제로 희석시까지는 정장을 제거하지 않더라도 생존성에 큰 영향을 미치지 않았으나 5℃에서 평형후에는 정장을 제거하지 않은 경우 대부분의 정자가 사멸하였다. 이에 따른 영향으로 정장제거 정액의 경우 동결·융해 이후 56%의 생존율을 보였으나 정장을 제거하지 않았을 경우 대부분의 정자는 사멸하였다. 4. 난황을 5%, 10% 및 20%의 농도로 첨가하였을 때 각 농도별 생존율은 50%, 41%, 54%로서 난황의 정액희석제내 20%첨가시 가장 좋은 성적을 보였다. 이는 앞에서 조사된 바와 같이 정액내 정장의 제거로 인해 난황응고현상과 정장내 효소의 영향이 제거된 것과 관련이 있을 것이다. 5. 평형시간별 동결·융해후 생존율이 1시간 25%, 1.5시간 42.5%, 2시간 54.2%, 2.5시간 51.7%를 나타내어 평형시간을 2시간으로 하였을 경우 가장 높은 생존율이 높으며 2.5시간 평형시켰을 경우에도 1시간이나 1.5시간에 비해 다소 높은 경향을 나타내었다. 6.간이동결의 경우 70%의 생존율을 나타낸 반면, 완만동결은 45%의 생존율을 나타내어 간이동결에 비해 동결방법이 복잡하고 고가의 세포동결기가 필요함에도 불구하고 동결융해후 생존성이 떨어짐을 알 수 있다. 7.CIDR+PGF_(2)α와 CIDR+PMSG 두처리구에서 CIDR삽입 후 progesterone농도가 상승하여 제거 당일까지 높은 수준의 progesterone의 혈중 농도를 유지하였다. 그러나 CIDR를 제거하면 다음날 바로 그 농도가 1ng/ml 이하 수준으로 떨어졌다. 8.CIDR+PGF_(2)α를 사용하였을 경우 신선정액에서 25%(2/8), 동결정액에서 20%(2/10)의 분만율을 나타내었다. 반면 CIDR+PMSG를 발정동기화 방법으로 사용하였을 경우 10두의 인공수정축에서 분만까지 도달하지는 못하였다. ○재래산양에서 체내수정란 및 이의 동결보존기술 및 체외수정란 생산에 관한 연구결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 발정동기화 및 과배란 처리를 위해 CIDR+FSH 및 CIDR+PMSG의 방법을 이용한 결과, 배란점 및 회수수정란의 수가 CIDR+FSH 처리구에서 16.3개 및 9.4개, CIDR+PMSG 처리구에서 16.4개 및 8.7개를 나타내어 두처리구간에 차이를 나타내지 않았다. 2. 회수한 수정란을 형태학적으로 평가한 결과 CIDR+FSH 처리구에서 A급 75.8%, B급 15.2%, C급 4.5%, D급 4.5%를 나타낸 반면 CIDR+PMSG 처리구에서는 A급 52.5%, B급 16.4%, C급 16.4%, D급 14.8%를 나타내어 회수된 수정란의 등급에서는 CIDR+FSH 처리구가 좋은 효과를 나타내었다. 3. 회수된 수정란을 완만동결법으로 처리구간 동결·융해를 실시하여, CIDR+FSH 처리구에서 73.3%, CIDR+PMSG 처리구에서 63.3%의 발달률을 나타내어 과배란처리방법에 따른 발달률의 뚜렷한 차이를 나타내지는 않았다. 그러나 초자화동결(vitrification)에서는 33.3%의 배발달률을 나타내어 완만동결이 초자화동결보다는 발달률이 좋은 것으로 조사되었다. 4. 흡입법(aspiration)과 세절법(slicing)에 의해 난소 한개당 회수된 난자의 수는 3.9개와 4.1개를 나타내어 slicing 방법이 aspiration 방법보다는 많은 숫자의 난자를 회수하였으나 유의적인 차이는 나타내지 않았다. 5. 회수된 난자의 등급별 분포는 aspiration법에서 Grade Ⅰ, Grade Ⅱ, Grade Ⅲ, Grade Ⅳ의 비율이 10.3%, 20.5%, 38.5%, 30.8%를 나타내었으며, slicing법에서 9.8%, 22.0%, 39.0%, 29.3%를 나타내어 Grade Ⅲ와 Grade Ⅳ의 비율이 70%이상을 차지하였다. 6. 회수된 난자를 체외성숙 시킨결과 난자의 질이 좋은 Grade Ⅰ과 Grade Ⅱ에서는 85% 이상이 methphase Ⅱ (MⅡ)까지 도달하였으나, 난자의 질이 떨어지는 Grade Ⅲ와 Grade Ⅳ 40%이하의 체외성숙율을 나타내었다. 7. 체외수정용 배양액으로 BO를 사용하였을 경우 회수난자의 질이 좋은 GⅠ 및 GⅡ에서 84.8%의 난분할율을 나타내어 TALP를 사용하였을 때의 58.8%보다 높은 난분할율을 나타내었다. 그러나 회수난자의 등급이 좋지않을 경우 수정란으로의 난분할율이 현저히 떨어지는 것으로 나타났다. 8. 체외배양액의 종류를 달리하였을 때 상실배기(morula) 및 포배기 (blastocyst)로의 발달을 M199 배양액에서는 이루지 못하였으나 mSOF를 배양액으로 이용하였을 경우 15.0%의 발달률을 나타내었으며 체외배양시 항산화물질인 glutathione (GSH)을 첨가함으로서 26.8%의 상실배 및 배반포배로의 발달률을 나타내었다. 이상의 결과는 재래산양 정액의 일반성상을 정립하고 이를 동결보존하며, 이와 더불어 수정란의 생산 및 이의 동결보존을 실시하므로서 우리나라 고유의 가축인 재래산양의 유전자원을 영구히 보존하는 기반이 마련될 수 있을 것으로 사료된다.
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