Molecular Characterization of the Luciferase Gene of the Firefies, Hotaria-group and Luciola lateralis : Luciola lateralis와 Hotaria-group 반딧불이의 루시페라제 유전자의 분자특성원문보기
본 연구는 Luciola latralis와 Hotaria-group 반딧불이로부터 루시페라제 유전자 클로닝, 발현 및 특성 분석과 함께 루시페라제 유전자의 아미노산 서열을 이용하여 반딧불이의 분자계통분석을 수행하였다. 아울러 루시페라제 유전자를 이용한 분자계통분석 결과의 신뢰도를 높이기 위하여, 미토콘드리아 DNA 사이토크롬 옥시다제 Ⅰ(CO Ⅰ) 유전자를 분석하였다. 우선, 운문산반딧불이(Hotaria unmunsana)로부터 루시페라제 cDNA를 클로닝하고, 곤충세포주에서 발현 및 특성을 분석하였다. 운문산반딧불이 루시페라제 cDNA는 특이적 ...
본 연구는 Luciola latralis와 Hotaria-group 반딧불이로부터 루시페라제 유전자 클로닝, 발현 및 특성 분석과 함께 루시페라제 유전자의 아미노산 서열을 이용하여 반딧불이의 분자계통분석을 수행하였다. 아울러 루시페라제 유전자를 이용한 분자계통분석 결과의 신뢰도를 높이기 위하여, 미토콘드리아 DNA 사이토크롬 옥시다제 Ⅰ(CO Ⅰ) 유전자를 분석하였다. 우선, 운문산반딧불이(Hotaria unmunsana)로부터 루시페라제 cDNA를 클로닝하고, 곤충세포주에서 발현 및 특성을 분석하였다. 운문산반딧불이 루시페라제 cDNA는 특이적 프라이머를 제작하여 RT-PCR을 통해 클로닝하였다. 운문산반딧불이 루시페라제 cDNA는 1,644 bp의 길이로 548개의 아미노산을 코딩하였다. 운문산반딧불이의 루시페라제 cDNA의 아미노산 서열은 H. parvula와 98%, L. mingrelica와 96.8%의 유사성을 보였다. 아울러 운문산 반딧불이의 루시페라제 cDNA의 아미노산과 이미 밝혀진 반딧불이의 루시페라제 아미노산들 간의 유전적 계통분석 결과, H, parvula, L. mingrelica와 더불어 Luciolinae에 속하여, 기존의 분류체계와 일치하였다. Southern blot 분석에서 운문산반딧불이의 루시페라제 유전자는 게놈 DNA 상에 한 개의 유전자로 존재하였으며, Northern blot 분석에선 루시페라제 유전자는 발광기관의 조직에서 특이적으로 발현하였다. 운문산반딧불이의 cDNA는 baculovirus 발현 벡터계에 의하여 곤충세포주에서 약 61 kDa의 polypeptide로 발현되었으며, 이 재조합 루시페라제를 이용하여 효소 활성을 검정하였다. 한편, Horaria-group 반딧불이 H. unmunsana, H. papariensis, H. tsusimana 및 H. parvula의 루시페라제 유전자의 genomic DNA를 클로닝하고 엑손/인트론 구조를 밝혔다. H. parvula의 루시페라제 유전자는 길이가 1,950 bp이고, 6개의 인트론과 7개의 엑손으로 구성되어 있었으며, 548개의 아미노산을 코딩하고 있었다. Hotaria-group 반딧불이에서 루시페라제 유전자의 genome 구조(6개의 인트론과 7개의 엑손) 및 아미노산 수(548잔기)는 잘 보존되었다. 이들 Hotaria-group 반딧불이의 루시페라제 유전자 변이를 분석하기 위하여, H. unmunsana, H. papariensis, 및 H. tsusimana 각각 4개체로부터 genomic DNA를 클로닝하고 아미노산 서열의 변이를 비교하였다. 그 결과, H. papariensis는 4개체 모두에서 단지 한 개의 유전자 타입으로 분석되었으나, H. unmunsana(Ul과 Uc)와 H, tsusimana(T1과 T2)는 각각 2개의 유전자 타입으로 나타났다. H. unmunsana, H, papariensis 및 H, tsusimana 내에서의 아마노산 서열의 변이는 0∼3개의 아미노산 잔기에서 변이를 보였으나, H. parvula는 다른 Hotaria-group 반딧불이 와 10∼11개 아미노산 잔기의 변이를 보였다. 본 연구에서 밝혀진 반딧불이 루시페라제 유전자의 아미노산 서열을 이용하여 계통 분석을 수행한 결과, H, unmunsana, H. papariensis 및 H. tsusimana는 단일그룹을 형성하였다. 부가적으로, Hotaria-group 반딧불이의 미토콘드리아 DNA의 CO Ⅰ 유전자를 분석하여, 각각 비교하였다. 그 결과, H unmunsana의 CO Ⅰ 아미노산 서열은 H. papariensis와 H. tsusimana와 동일하였으나, H. parvula와는 3개의 아미노산 변이를 보였다. 결론적으로, 이상의 결과는 적어도 루시페라제와 CO Ⅰ 유전자에 근거하여 볼 때, H. unmunsana, H. papariensis와 H. tsusimana 세 종은 매우 가까운 근연관계를 가지고 있거나 동일한 종으로 사료된다. 또한, Luciola lateralis의 루시페라제 유전자의 완전한 염기서열과 엑손/ 인트론의 구조를 분석하였다. L. lateralis의 루시페라제 유전자의 길이는 1,971 bp이고, 6개의 인트론과 7개의 엑손으로 구성되어 있었으며, 548개의 아미노산을 코딩하고 있었다. 본 연구에서 국내서식 L. lateralis 표본으로부터 세 가지 타입의 루시페라제 유전자의 isoform (BU, MJ1 및 MJ2)을 클로닝하였다. BU 타입의 L. lateralis 루시페라제 유전자는 MJl 및 MJ2 타입과 각각 한 개씩의 아미노산 변이를 나타내었다 MJl과 MJ2 타입의 L. lateralis 반딧불이 루시페라제 유전자는 국내에서 이미 알려진 유전자 타입과 일치하나, BU 타입 유전자는 본 연구에서 처음으로 밝혀졌다. 근연관계 분석에서 국내의 L. lateralis 반딧불이 루시페라제 유전자들 간에는 단지 1∼2개의 아미노산 잔기에서 변이를 보이는 반면, 일본서식 L. lateralis와는 5∼6개의 아미노산 잔기에서 변이를 보였다. 게다가 루시페라제 유전자의 아미노산 서열을 이용한 분자계통 분석에서도 또한, 일본서식 L. lateralis 반딧불이와 국내 L. lateralis와는 구분되었다.
본 연구는 Luciola latralis와 Hotaria-group 반딧불이로부터 루시페라제 유전자 클로닝, 발현 및 특성 분석과 함께 루시페라제 유전자의 아미노산 서열을 이용하여 반딧불이의 분자계통분석을 수행하였다. 아울러 루시페라제 유전자를 이용한 분자계통분석 결과의 신뢰도를 높이기 위하여, 미토콘드리아 DNA 사이토크롬 옥시다제 Ⅰ(CO Ⅰ) 유전자를 분석하였다. 우선, 운문산반딧불이(Hotaria unmunsana)로부터 루시페라제 cDNA를 클로닝하고, 곤충세포주에서 발현 및 특성을 분석하였다. 운문산반딧불이 루시페라제 cDNA는 특이적 프라이머를 제작하여 RT-PCR을 통해 클로닝하였다. 운문산반딧불이 루시페라제 cDNA는 1,644 bp의 길이로 548개의 아미노산을 코딩하였다. 운문산반딧불이의 루시페라제 cDNA의 아미노산 서열은 H. parvula와 98%, L. mingrelica와 96.8%의 유사성을 보였다. 아울러 운문산 반딧불이의 루시페라제 cDNA의 아미노산과 이미 밝혀진 반딧불이의 루시페라제 아미노산들 간의 유전적 계통분석 결과, H, parvula, L. mingrelica와 더불어 Luciolinae에 속하여, 기존의 분류체계와 일치하였다. Southern blot 분석에서 운문산반딧불이의 루시페라제 유전자는 게놈 DNA 상에 한 개의 유전자로 존재하였으며, Northern blot 분석에선 루시페라제 유전자는 발광기관의 조직에서 특이적으로 발현하였다. 운문산반딧불이의 cDNA는 baculovirus 발현 벡터계에 의하여 곤충세포주에서 약 61 kDa의 polypeptide로 발현되었으며, 이 재조합 루시페라제를 이용하여 효소 활성을 검정하였다. 한편, Horaria-group 반딧불이 H. unmunsana, H. papariensis, H. tsusimana 및 H. parvula의 루시페라제 유전자의 genomic DNA를 클로닝하고 엑손/인트론 구조를 밝혔다. H. parvula의 루시페라제 유전자는 길이가 1,950 bp이고, 6개의 인트론과 7개의 엑손으로 구성되어 있었으며, 548개의 아미노산을 코딩하고 있었다. Hotaria-group 반딧불이에서 루시페라제 유전자의 genome 구조(6개의 인트론과 7개의 엑손) 및 아미노산 수(548잔기)는 잘 보존되었다. 이들 Hotaria-group 반딧불이의 루시페라제 유전자 변이를 분석하기 위하여, H. unmunsana, H. papariensis, 및 H. tsusimana 각각 4개체로부터 genomic DNA를 클로닝하고 아미노산 서열의 변이를 비교하였다. 그 결과, H. papariensis는 4개체 모두에서 단지 한 개의 유전자 타입으로 분석되었으나, H. unmunsana(Ul과 Uc)와 H, tsusimana(T1과 T2)는 각각 2개의 유전자 타입으로 나타났다. H. unmunsana, H, papariensis 및 H, tsusimana 내에서의 아마노산 서열의 변이는 0∼3개의 아미노산 잔기에서 변이를 보였으나, H. parvula는 다른 Hotaria-group 반딧불이 와 10∼11개 아미노산 잔기의 변이를 보였다. 본 연구에서 밝혀진 반딧불이 루시페라제 유전자의 아미노산 서열을 이용하여 계통 분석을 수행한 결과, H, unmunsana, H. papariensis 및 H. tsusimana는 단일그룹을 형성하였다. 부가적으로, Hotaria-group 반딧불이의 미토콘드리아 DNA의 CO Ⅰ 유전자를 분석하여, 각각 비교하였다. 그 결과, H unmunsana의 CO Ⅰ 아미노산 서열은 H. papariensis와 H. tsusimana와 동일하였으나, H. parvula와는 3개의 아미노산 변이를 보였다. 결론적으로, 이상의 결과는 적어도 루시페라제와 CO Ⅰ 유전자에 근거하여 볼 때, H. unmunsana, H. papariensis와 H. tsusimana 세 종은 매우 가까운 근연관계를 가지고 있거나 동일한 종으로 사료된다. 또한, Luciola lateralis의 루시페라제 유전자의 완전한 염기서열과 엑손/ 인트론의 구조를 분석하였다. L. lateralis의 루시페라제 유전자의 길이는 1,971 bp이고, 6개의 인트론과 7개의 엑손으로 구성되어 있었으며, 548개의 아미노산을 코딩하고 있었다. 본 연구에서 국내서식 L. lateralis 표본으로부터 세 가지 타입의 루시페라제 유전자의 isoform (BU, MJ1 및 MJ2)을 클로닝하였다. BU 타입의 L. lateralis 루시페라제 유전자는 MJl 및 MJ2 타입과 각각 한 개씩의 아미노산 변이를 나타내었다 MJl과 MJ2 타입의 L. lateralis 반딧불이 루시페라제 유전자는 국내에서 이미 알려진 유전자 타입과 일치하나, BU 타입 유전자는 본 연구에서 처음으로 밝혀졌다. 근연관계 분석에서 국내의 L. lateralis 반딧불이 루시페라제 유전자들 간에는 단지 1∼2개의 아미노산 잔기에서 변이를 보이는 반면, 일본서식 L. lateralis와는 5∼6개의 아미노산 잔기에서 변이를 보였다. 게다가 루시페라제 유전자의 아미노산 서열을 이용한 분자계통 분석에서도 또한, 일본서식 L. lateralis 반딧불이와 국내 L. lateralis와는 구분되었다.
The complete organization of the genomic structure of the luciferase gene in the fireflies Hotaria-group and Luciola lateralis was illustrated in the study. In an attempt to infer phylogenetic relationships of the fireflies, the luciferase gene was sequenced and compared the sequences. Furthermore, ...
The complete organization of the genomic structure of the luciferase gene in the fireflies Hotaria-group and Luciola lateralis was illustrated in the study. In an attempt to infer phylogenetic relationships of the fireflies, the luciferase gene was sequenced and compared the sequences. Furthermore, the mitochondrial DNA cytochrome oxidase I(CO I) gene was also analyzed to provide an additional phylogenetic marker. A cDNA encoding the luciferase from the firefly, Hotaria unmunsana, was cloned and characterized. The cDNA encoding the luciferase of H. unmunsana was isolated by RT-PCR with a gene-specific primer set. The cDNA encoding the luciferase of H. unmunsana is 1644 base pairs long with an open reading frame of 548 amino acid residues. The deduced amino acid sequence of the luciferase gene of H. unmunsana showed 98.0 and 96.8% identity to H. paruula and Luctola mingrelicu, respectively. Phylogenetic analysis further confirmed that the deduced amino acid sequences of the H. unmunsana luciferase gene belonged to the same subfamily, Luciolinae. Southern blot analysis of genomic DNA suggested the presence of the H. unmunsana luciferase gene as a single copy and Northern blot analysis confirmed light organ-specific expression at the transcriptional level, The cDNA encoding the luciferase of H. unmunsana was expressed as a 61 kDa band in the baculovirus-infected insect cells and the extracts of the recombinant baculovirus-infected cells emitted luminescence in the luciferase activity assay. The luminescent fireflies have species specific flash patterns, being recognized as sexual communication. The luciferase gene is the sole enzyme responsible for bioluminescence. We describe here the complete nucleotide sequence and the exon/intron structure of the luciferase gene of the Hotaria-group fireflies, H. unmunsana, H. papariensis and H. tsushimana, were investigated The luciferase gene of the Hotaria-group firefly including the known H. parvula spans 1,950 bp and consisted of six intrans and seven exons coding for 548 amino acid residues, suggesting highly conserved structure among the Hotaria-group fireflies. Although only one luciferase gene was cloned from H. papariensis, each of the two sequences of the gene was found in H. unmunsana (Ul and Uc) and H. tsushimana (Tl and T2). The amino acid sequence divergence among H. unmunsana, H. papariensis, and H. tsushimana only ranged from zero to three amino acid residues, but H. parvula differed by 10-11 amino acid residues from the other Hotaria-group fireflies, suggesting a divergent relationship of this species. Phylogenetic analysis using the deduced amino acid sequences of the luciferase gene resulted in a monophyletic group in the Hotaria excluding H. parvula, suggesting a close relationship among H. unmunsana, H. papariensis and H. tsushimana. Additionally, we also analyzed the mitochondrial cytochrome oxidase I(COI) gene of the Hotaria-group fireflies. The deduced amino acid sequence of the COI gene of H. unmunsana was identical to that of H. papariensis and H. tsushimana, but different by three positions from H. parvula. In terms of nucleotide sequences of the COI gene, intraspecific sequence divergence was sometimes larger than interspecies level, and phylogenetic analysis placed the three species into monophyletic groups unresolved among them, but excluded H. parvula. In conclusion, these results suggest that H. unmunsana, H. papariensis and H. tsushimana are very closely related or might be an identical species, at least based on the luciferase and COI genes. The complete nucleotide sequence and the exon-intron structure of the luciferase gene of the firefly, Luciola lateralis, were investigated. The luciferase gene of the L. lateralis firefly spans 1,971 bp and consisted of six intrans and seven exons coding for 548 amino acid residues. From L. lateralis firefly sampled in Korea, we cloned three isoform luciferase genes, named BU, MJ1 and MJ2, respectively. The amino acid sequence of the L. lateralis luciferase BU type differed from MJ1 and MJ2 types by one amino acid, respectively. The luciferase gene of MJ1 and MJ2 types were identical to that of the L. lateralis firefly known in Korea, but BU type of L. lateralis firefly luciferase gene is novel. The luciferase sequence divergence among L. lateralis fireflies sampled in Korea only ranged from 1∼2 amino acid residues, but L. lateralis firefly known in Japan differed 5∼6 amino acid residues from the Korean L. lateralis firefly, suggesting a divergent relationship of this species. Furthermore, phylogenetic analysis using the amino acid sequences of luciferase gene resulted in a monophyletic group in the Korean L. lateralis firefly excluding Japanese L. lateralis firefly.
The complete organization of the genomic structure of the luciferase gene in the fireflies Hotaria-group and Luciola lateralis was illustrated in the study. In an attempt to infer phylogenetic relationships of the fireflies, the luciferase gene was sequenced and compared the sequences. Furthermore, the mitochondrial DNA cytochrome oxidase I(CO I) gene was also analyzed to provide an additional phylogenetic marker. A cDNA encoding the luciferase from the firefly, Hotaria unmunsana, was cloned and characterized. The cDNA encoding the luciferase of H. unmunsana was isolated by RT-PCR with a gene-specific primer set. The cDNA encoding the luciferase of H. unmunsana is 1644 base pairs long with an open reading frame of 548 amino acid residues. The deduced amino acid sequence of the luciferase gene of H. unmunsana showed 98.0 and 96.8% identity to H. paruula and Luctola mingrelicu, respectively. Phylogenetic analysis further confirmed that the deduced amino acid sequences of the H. unmunsana luciferase gene belonged to the same subfamily, Luciolinae. Southern blot analysis of genomic DNA suggested the presence of the H. unmunsana luciferase gene as a single copy and Northern blot analysis confirmed light organ-specific expression at the transcriptional level, The cDNA encoding the luciferase of H. unmunsana was expressed as a 61 kDa band in the baculovirus-infected insect cells and the extracts of the recombinant baculovirus-infected cells emitted luminescence in the luciferase activity assay. The luminescent fireflies have species specific flash patterns, being recognized as sexual communication. The luciferase gene is the sole enzyme responsible for bioluminescence. We describe here the complete nucleotide sequence and the exon/intron structure of the luciferase gene of the Hotaria-group fireflies, H. unmunsana, H. papariensis and H. tsushimana, were investigated The luciferase gene of the Hotaria-group firefly including the known H. parvula spans 1,950 bp and consisted of six intrans and seven exons coding for 548 amino acid residues, suggesting highly conserved structure among the Hotaria-group fireflies. Although only one luciferase gene was cloned from H. papariensis, each of the two sequences of the gene was found in H. unmunsana (Ul and Uc) and H. tsushimana (Tl and T2). The amino acid sequence divergence among H. unmunsana, H. papariensis, and H. tsushimana only ranged from zero to three amino acid residues, but H. parvula differed by 10-11 amino acid residues from the other Hotaria-group fireflies, suggesting a divergent relationship of this species. Phylogenetic analysis using the deduced amino acid sequences of the luciferase gene resulted in a monophyletic group in the Hotaria excluding H. parvula, suggesting a close relationship among H. unmunsana, H. papariensis and H. tsushimana. Additionally, we also analyzed the mitochondrial cytochrome oxidase I(COI) gene of the Hotaria-group fireflies. The deduced amino acid sequence of the COI gene of H. unmunsana was identical to that of H. papariensis and H. tsushimana, but different by three positions from H. parvula. In terms of nucleotide sequences of the COI gene, intraspecific sequence divergence was sometimes larger than interspecies level, and phylogenetic analysis placed the three species into monophyletic groups unresolved among them, but excluded H. parvula. In conclusion, these results suggest that H. unmunsana, H. papariensis and H. tsushimana are very closely related or might be an identical species, at least based on the luciferase and COI genes. The complete nucleotide sequence and the exon-intron structure of the luciferase gene of the firefly, Luciola lateralis, were investigated. The luciferase gene of the L. lateralis firefly spans 1,971 bp and consisted of six intrans and seven exons coding for 548 amino acid residues. From L. lateralis firefly sampled in Korea, we cloned three isoform luciferase genes, named BU, MJ1 and MJ2, respectively. The amino acid sequence of the L. lateralis luciferase BU type differed from MJ1 and MJ2 types by one amino acid, respectively. The luciferase gene of MJ1 and MJ2 types were identical to that of the L. lateralis firefly known in Korea, but BU type of L. lateralis firefly luciferase gene is novel. The luciferase sequence divergence among L. lateralis fireflies sampled in Korea only ranged from 1∼2 amino acid residues, but L. lateralis firefly known in Japan differed 5∼6 amino acid residues from the Korean L. lateralis firefly, suggesting a divergent relationship of this species. Furthermore, phylogenetic analysis using the amino acid sequences of luciferase gene resulted in a monophyletic group in the Korean L. lateralis firefly excluding Japanese L. lateralis firefly.
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