고추 탄저병 저항성 계통 육성을 위한 종간교잡과 그 후대의 특성에 관한 연구 Study on the characteristics of interspecific hybrids and their progenies for the breeding of anthracnose-resistant chili lines원문보기
고추는 우리의 식생활에서 가장 중요한 양념채소로서 재배면적이나 생산액에서 원예작물 중 가장 중요한 위치를 차지하며 우리나라 농업 전체에서 벼 다음에 위치하는 중요 작물이다. 고추 탄저병은 해마다 발병률이 증가하여 우리나라 고추 생산에 있어 역병과 함께 가장 중요한 제한 요인 중의 하나가 되었다. 고추 탄저병 방제를 위해 가장 효과적이고 경제적인 방제 방법은 저항성 품종의 육성이다. 본 연구는 다양한 유전자원을 평가하여 고추 탄저병 저항성 자원을 선발하고, Capsicum baccatum var. pendulum의 탄저병 저항성을 ...
고추는 우리의 식생활에서 가장 중요한 양념채소로서 재배면적이나 생산액에서 원예작물 중 가장 중요한 위치를 차지하며 우리나라 농업 전체에서 벼 다음에 위치하는 중요 작물이다. 고추 탄저병은 해마다 발병률이 증가하여 우리나라 고추 생산에 있어 역병과 함께 가장 중요한 제한 요인 중의 하나가 되었다. 고추 탄저병 방제를 위해 가장 효과적이고 경제적인 방제 방법은 저항성 품종의 육성이다. 본 연구는 다양한 유전자원을 평가하여 고추 탄저병 저항성 자원을 선발하고, Capsicum baccatum var. pendulum의 탄저병 저항성을 재배종 고추인 C. annuum에 도입하고, 종간잡종 유래 탄저병 저항성 계통의 저항성 발현에 관련된 유전자를 탐색하고자 수행되었다. 총 1,222점의 고추 유전자원에 대하여 탄저병 저항성을 평가한 결과 C. baccatum에 속하는 7점과 C. chinense에 속하는 1점을 선발하였다. 이 중에는 원예연구소에서 육종재료로 기 보유하고 있는 4점 이외에 새로운 탄저병 저항성 유전자원으로 C. baccatum에 속하는 4점을 선발하였다. 탄저병 저항성 평가에 이용된 고추 유전자원 1,222점을 종별로 보면 95.7%가 C. annuum에 속하고, 나머지 4.3%가 야생종이었다. 따라서 야생종을 대상으로 한 탄저병저항성 검정은 제한적이었다. 탄저병 저항성 재료로 선발된 것 중에서 C. baccatum var. pendulum에 속하는 881045의 고추 탄저병 저항성 유전자를 재배종인 C. annuum에 도입하기 위하여 이에 속하는 Long Fruit(L.F.) 등 5품종과 교잡을 수행하였다. 그 결과 881045/Long Fruit(L.F.) 조합에서 가임인 9개의 F1을 얻을 수 있었으며, F2 세대에서는 탄저병에 저항성인 3개체를 얻을 수 있었다. F2 세대에서 저항성이었던 1개체에 C. baccatum var. pendulum 881045와 교배한 BC1F1을 자식한 다음 세대 즉, BC1F2, BC1F3, BC1F4, BC1F5 집단을 대상으로 연구한 결과는 다음과 같다. 종간교잡 F1은 꽃잎에 C. baccatum의 특징인 노란-녹색 점무늬를 보유하였고, 식물체의 크기를 나타내는 초형 지수는 양친보다 크고, 잎의 크기를 나타내는 엽형 지수는 C. baccatum 친에 가까웠다. 그리고 꽃잎 길이와 폭, 화경의 굵기는 양친의 중간이었다. 종간 잡종 F1을 자가수분시켜 24개의 F2 식물체를 얻었다. F2 개체들은 대부분 불임이었고, 가임은 3주뿐이었다. 그리고 종간 잡종 F1을 자방친으로 하고 C. annuum을 화분친으로 한 여교잡을 통해 BC1F1 38개체를 얻었으나 모두 불임이었다. 탄저병 저항성을 평가한 결과 F2 세대 3개체는 모두가 탄저병에 저항성을 나타냈으나 C. annuum과의 BC1F1 10개체에 C. annuum의 화분을 이용하여 착과시킨 식물 10개체 중 1개체만 탄저병에 저항성을 나타내고 나머지 9주는 모두 감수성을 나타냈다. F2 개체 중 탄저병에 저항성이고 임성이 정상인 개체를 선발하여 C. annuum 에 속하는 재배품종을 자방친 혹은 화분친으로 이용하여 교배를 하였다. 획득한 F1은 임성이 매우 낮아 10.5-14%에 불과하였다. 그러나 원래 종간잡종 작성의 친으로 사용되었던 품종과 여교배를 할 경우 C. annuum 과 교배한 F1은 29.7%, C. baccatum과 교배한 F1은 73.5%의 높은 임성을 나타냈다. 종간잡종 F2 세대에서 저항성을 나타낸 개체와 C. baccatum간 여교잡하여 분리한 개체 중에서 탄저병에 저항성을 나타낸 18개체의 후대를 노지포장에 정식하여 탄저병 포장저항성을 평가하였다. 재배기간 중 살균제를 전혀 살포하지 않고 재배한 결과 탄저병 저항성 친으로 사용된 881045보다 저항성이 약간 낮거나 대등한 수준의 저항성을 나타낸 4계통을 선발하였다. 선발된 계통을 세대진전하여 AFLP에 의해 만들어진 다형성을 이용하여 양친 및 종간잡종 후대 62개체의 유전 조성을 비교하였다. 탄저병에 강한 저항성을 보이는 개체들은 L.F.보다 881045에 더 가까운 유전조성을 가진 것으로 나타났다. 종간잡종 후대 2계통 내 개체별 탄저병 저항성과 유전조성을 비교하였다. 그 결과 유전조성은 개체 간 차이가 거의 없음에도 불구하고 탄저병 병반의 크기는 매우 다양하게 분포하였다. 탄저병 저항성은 특정한 유전자 혹은 몇 개의 주동 유전자에 의해 좌우되는 것으로 판명되었다. C. baccatum var. pendulum과 C. annuum 간 종간잡종 후대 탄저병 저항성 계통들은 어린 유과기에서 성숙한 녹과시기까지 glucose의 함량 비율이 매우 높았다. 반면에 탄저병에 약한 품종들은 glucose의 비율이 낮고 sucrose의 비율이 높았다. 당의 종류와 탄저병 저항성과의 상관관계를 분석한 결과 glucose의 함량과 탄저병저항성은 정의 상관이 있으며, sucrose의 함량과는 부의 상관이 있었다. 재배품종으로 종간잡종 후대의 탄저병 저항성을 도입하기 위한 기초 정보를 얻기 위하여 교배효율 및 화합성을 평가하였다. 교배에 이용한 계통을 자식하고, C. annuum에 속하나 각기 유형이 다른 품종을 이용하여 F1을 작성하였다. 자가 수정할 경우 평균종자수가 종간잡종 후대 탄저병 저항성 계통은 23.5립, 재배품종은 84.7립이었다. 그러나 종간잡종 후대를 일반 재배품종과 교배한 과실의 종자(F1)수는 33.4립으로 종간잡종 후대를 자가 수정하였을 때의 종자수 보다 많았다. 이상의 결과로 보아 탄저병 저항성으로 육성된 4계통은 C. annuum에 속하는 어느 유형의 품종과 교배시에도 쉽게 후대를 얻을 수 있어 앞으로 탄저병 저항성 우량 품종 육성에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 본다. 종간 잡종 유래 고추 탄저병 저항성 계통의 탄저병 저항성 유전양식을 조사하기 위하여, 종간 잡종 유래 고추 탄저병 저항성 계통과 C. annuum에 속하는 두 품종 간에 작성된 F1 조합의 탄저병 저항성을 평가하였다. F1 조합별로 90%, 71.4%가 탄저병이 발병하였고, 병반길이는 감수성 친과 비슷하거나 더 심하게 나타났다. 두 조합 모두가 탄저병에 약한 것으로 나타나 C. baccatum var. pendulum의 탄저병 저항성이 도입된 종간잡종 후대 계통의 탄저병 저항성 유전양식은 열성유전으로 판단되었다. 그리고 881045과 같은 종에 속하면서 탄저병에 약한 특징을 가지고 있는 ‘Golden Aji'와 교배하여 분리한 F2 세대 223개체의 탄저병 저항성을 조사하였다. 평가된 집단의 7.1%의 개체가 저항성 친 881045과 비슷한 수준의 저항성을 나타냈다. 그리고 전체의 67.7%는 감수성친으로 사용된 'Golden Aji'보다 저항성이 약한 것으로 나타나 열성 유전자임을 암시해 주고 있다. 종간잡종 유래 탄저병 저항성 계통이 나타내는 저항성 기작을 이해하기 위해서 저항성 개체와 감수성 개체에 탄저병을 접종하고 저항성 개체에서만 독특하게 발현되거나 현저하게 크게 발현되는 유전자(DEGs)를 탐색하였다. DEGs의 탐색에는 dT-ACP2(reverse primer)와 120개의 arbitrary ACPs (forward primer)를 조합하여 사용하는 GeneFishingTM DEG kits를 이용한 ACP-based PCR 방법을 이용하였다. 감수성 계통과는 다르게 탄저병 저항성 계통에서 특이적으로 또는 현저하게 높게 발현된 cDNA band 23개가 전개되었다. Differentially expressed cDNAs에 대한 서열 분석 결과 5개의 DEG이 NCBI GenBank에 알져져 있는 유전자의 coding region과 매우 유사한 것으로 밝혀졌다. GP26, GP71, GP80, GP92, 그리고 GP108의 서열은 각기 72, 71, 66, 75, 그리고 76% 정도의 homology로 S-adenosyl methionine synthase I, Snakin2, DDI1, tryptophan synthase 2 beta chain, 그리고 pepper mild mottle virus와 동일한 것으로 나타났다. 9개 DEGs의 cDNA 서열은 정확한 기능은 밝혀지지 않았으나 hypothetical 단백질과 동일성을 나타냈다. 이 결과에 의하면 종간잡종 유래 계통은 탄저병균의 침입에 대항하여 과민성반응에 의해 탄저병균의 증식을 억제하는 기작을 가지고 있는 것으로 추정된다. 그리고 항균물질의 합성, 손상된 DNA 복구 및 아미노산과 단백질의 합성 강화, 그리고 스트레스에 대한 저항성이 향상된 것으로 밝혀졌다. 마지막으로 DEGs 탐색을 통해서 아직까지 전혀 알려지지 않았던 탄저병 저항성 발현 관련 단백질 유전자를 5개 찾을 수 있었다. As a major ingredient in making kimchi and gochujang (chili paste), chili pepper has been widely cultivated as one of the main spice plants in Korea. It is one of the most important agricultural commodities next to rice in terms of farm household's income. Anthracnose disease, one of the limiting factors together with late blight disease in pepper production in Korea, has increased its level of damage every year. Considering the long life-span of the plant, breeding resistant varieties has been considered the most effective and economic way to controlthis disease. This study was undertaken to find anthracnose-resistant breeding materials by evaluating various pepper germplasm by artificial inoculation, and to introduce the resistance found in Capsicum baccatum var. pendulum into C. annuum, one of the cultivated species. An attempt was also made to find genes differentially expressed in the resistant progenies derived from interspecific hybrid between C. baccatum var. pendulum and C. annuum. A total of 1,222 accessions of pepper germplasm were screened for resistance against anthracnose. Of the 1,222 accessions screened, 1,169 accessions (95.7%) belonged to C. annuum, and the rest were wild Capsicum species. Seven accessions of C. baccatum var. pendulum and one accession of C. chinense were selected for anthracnose resistance. As no accession was selected among C. annuum, it was concluded that anthracnose resistance is found only in the wild species of Capsicum. To introduce the anthracnose-resistant gene(s) into cultivated pepper, 881045, one of the C. baccatum var. pendulum selected for resistance against anthracnose, was crossed to five cultivars of C. annuum. As a result, 9 interspecific fertile plants were obtained, and 3 resistant plants were selected in F2 generation. A backcross, BC1F1 , was made between a selected resistant plant in F2 and 881045, and subsequent generations to BC1F5 generation were developed. The interspecific hybrid had yellow-green spots on petals. This characteristic is a distinctive morphological trait of C. baccatum. The plant was bigger than its parents, and the leaf shape index was similar to that of the C. baccatum parent. The length and width of petals and petiole diameter were medium in size compared with its parents. Twenty-four F2 plants were obtained from the interspecific hybrid, but only three plants were fertile. The fertile F2 plants were all anthracnose resistant. A total of 10 BC1F1 plants were also obtained from a cross between the interspecific hybrid as the seed parent and C. annuum. All of the BC1F1 plants were sterile and only one out of the 10 plants was resistant to anthracnose. Selected anthracnose-resistant F2 plants were crossed with C. annuum cultivars by using either male or female parent. Fertility of the obtained F1s was 10.5%-14%, whereas fertility was considerably high in the backcrossed progenies obtained from crosses between the selected F2 plant and either parent used in making original interspecific hybrid (BC1F1 hereafter). A high fertility of 73.5% was obtained when the F2 plant was crossed to 881045, and 29.7% fertility was observed in the cross of the F2 plant and C. annuum L.F.. Anthracnose-resistant plants were selected from the progeny of the cross between the selected F2 plant and 881045. The progenies of thus selected 18 plants were further evaluated for anthracnose resistance in open-field conditions without chemical spraying. Four lines with comparable resistance as 881045 or a little less resistance to anthracnose were selected and advanced for higher generations. Sixty-two plants including the progenies derived from the four selected lines and parents were compared for genetic composition as characterized by the amplified fragment length polymorphism (AFLP). DNA composition of anthracnose-resistant plants was more similar to that of C. baccatum var. pendulum 881045 than that of C. annuum L.F.. The DNA composition and the lesion diameter developed after artificial inoculation was compared in two selected lines derived from interspecific hybrid. The lesion diameter varied widely, despite similar DNA composition of the individual plants. It was postulated that resistance against anthracnose is regulated by a specific gene or a few major genes. The anthracnose-resistant lines from interspecific hybrid showed high glucose content in fruits, but susceptible cultivars showed higher sucrose content than glucose. Based on the Pearson correlation coefficients analysis, the lesion diameter was negatively correlated to the glucose content of the fruits, whereas it was positively correlated to the sucrose content. To obtain basic information in introducing anthracnose resistance into cultivated pepper, cross compatibility and cross efficiency were evaluated in the developed anthracnose-resistant lines from interspecific hybrid. The cross compatibility was compared in F1s as expressed by the number of seed setting. The seed count after selfing was 23.5 in the interspecific lines and 84.7 in commercial cultivars. The seed count was as high as 33.4 in hybrids between the interspecific lines and commercial cultivars. This seed count was significantly higher than the number of selfed-seeds of interspecific hybrids. Therefore, the four breeding lines developed in this study could be efficiently used for introgression of anthracnose-resistant gene(s) into various types of cultivars belonging to C. annuum. To elucidate the inheritance mode of anthracnose resistance from interspecific hybrid, resistance against anthracnose of two F1 combinations between interspecific hybrid lines and cultivars of C. annuum was evaluated by artificial inoculation. The percent infection in two F1 combinations was 90% and 71.4%, respectively, and the lesion diameter was equal to or slightly smaller than that of the susceptible parents. As both F1 combinations were susceptible to anthracnose, the resistance in the interspecific hybrid lines was postulated as a recessively inherited trait. A similar study was conducted in an F2 progeny of 223 plants derived from a cross between two lines of C. baccatum var. pendulum, a resistant line 881045 and a susceptible line 'Golden Aji'. A small number of plants, 7.1%, were classified as resistant as similar level of 881045, and 67.7% of the F2 individuals were susceptible. This result supported the hypothesis that recessive gene(s) control the resistance. To characterize the mechanism of resistant gene(s) derived from interspecific hybrid lines in the molecular level, the specifically or differentially expressed genes in the resistant or susceptible plants after artificial inoculation were screened. Differentially expressed genes (DEG) identified by a combination of dT-ACP2 (reverse primer) and 120 arbitrary ACP primers (forward primer) were detected by ACP-based PCR method through the GeneFishingTM DEG kits. Twenty-three differentially expressed cDNA bands appeared on the anthracnose-resistant lines, whereas no band was developed in susceptible lines. By sequence analysis of the differentially expressed cDNAs, five DEGs were matched with sequences in NCBI GenBank databases with high homology. Nine other DEGs were matched with hypothetical proteins with unknown functions of highly significant homology. GP26 sequence is matched to the S-adenosyl methionine synthase I with 72% homology, GP71 with Snakin2 with 71%homology, GP80 with DDI1 with 66% homology, GP92 with tryptophan synthase 2 beta chain sequence with 75% homology, and GP108 with pepper mild mottle virus sequence with 76%. In summary, DEG results showed that the hypersensitive reaction of the interspecific hybrid lines against anthracnose might be caused by a series of molecular biological mechanism responding to the invasion and multiplication of the anthracnose fungi. It was found in the study that the synthesis of antimicrobial components, amino acids and proteins, repair mechanism of damaged DNA, and adaptation to stress followed by the invasion of fungus were all enhanced. With these results, further analysis of all detected DEGs is needed to understand fully the mechanisms of the resistant and/or susceptible gene(s) responsible for the anthracnose resistance in pepper.
고추는 우리의 식생활에서 가장 중요한 양념채소로서 재배면적이나 생산액에서 원예작물 중 가장 중요한 위치를 차지하며 우리나라 농업 전체에서 벼 다음에 위치하는 중요 작물이다. 고추 탄저병은 해마다 발병률이 증가하여 우리나라 고추 생산에 있어 역병과 함께 가장 중요한 제한 요인 중의 하나가 되었다. 고추 탄저병 방제를 위해 가장 효과적이고 경제적인 방제 방법은 저항성 품종의 육성이다. 본 연구는 다양한 유전자원을 평가하여 고추 탄저병 저항성 자원을 선발하고, Capsicum baccatum var. pendulum의 탄저병 저항성을 재배종 고추인 C. annuum에 도입하고, 종간잡종 유래 탄저병 저항성 계통의 저항성 발현에 관련된 유전자를 탐색하고자 수행되었다. 총 1,222점의 고추 유전자원에 대하여 탄저병 저항성을 평가한 결과 C. baccatum에 속하는 7점과 C. chinense에 속하는 1점을 선발하였다. 이 중에는 원예연구소에서 육종재료로 기 보유하고 있는 4점 이외에 새로운 탄저병 저항성 유전자원으로 C. baccatum에 속하는 4점을 선발하였다. 탄저병 저항성 평가에 이용된 고추 유전자원 1,222점을 종별로 보면 95.7%가 C. annuum에 속하고, 나머지 4.3%가 야생종이었다. 따라서 야생종을 대상으로 한 탄저병저항성 검정은 제한적이었다. 탄저병 저항성 재료로 선발된 것 중에서 C. baccatum var. pendulum에 속하는 881045의 고추 탄저병 저항성 유전자를 재배종인 C. annuum에 도입하기 위하여 이에 속하는 Long Fruit(L.F.) 등 5품종과 교잡을 수행하였다. 그 결과 881045/Long Fruit(L.F.) 조합에서 가임인 9개의 F1을 얻을 수 있었으며, F2 세대에서는 탄저병에 저항성인 3개체를 얻을 수 있었다. F2 세대에서 저항성이었던 1개체에 C. baccatum var. pendulum 881045와 교배한 BC1F1을 자식한 다음 세대 즉, BC1F2, BC1F3, BC1F4, BC1F5 집단을 대상으로 연구한 결과는 다음과 같다. 종간교잡 F1은 꽃잎에 C. baccatum의 특징인 노란-녹색 점무늬를 보유하였고, 식물체의 크기를 나타내는 초형 지수는 양친보다 크고, 잎의 크기를 나타내는 엽형 지수는 C. baccatum 친에 가까웠다. 그리고 꽃잎 길이와 폭, 화경의 굵기는 양친의 중간이었다. 종간 잡종 F1을 자가수분시켜 24개의 F2 식물체를 얻었다. F2 개체들은 대부분 불임이었고, 가임은 3주뿐이었다. 그리고 종간 잡종 F1을 자방친으로 하고 C. annuum을 화분친으로 한 여교잡을 통해 BC1F1 38개체를 얻었으나 모두 불임이었다. 탄저병 저항성을 평가한 결과 F2 세대 3개체는 모두가 탄저병에 저항성을 나타냈으나 C. annuum과의 BC1F1 10개체에 C. annuum의 화분을 이용하여 착과시킨 식물 10개체 중 1개체만 탄저병에 저항성을 나타내고 나머지 9주는 모두 감수성을 나타냈다. F2 개체 중 탄저병에 저항성이고 임성이 정상인 개체를 선발하여 C. annuum 에 속하는 재배품종을 자방친 혹은 화분친으로 이용하여 교배를 하였다. 획득한 F1은 임성이 매우 낮아 10.5-14%에 불과하였다. 그러나 원래 종간잡종 작성의 친으로 사용되었던 품종과 여교배를 할 경우 C. annuum 과 교배한 F1은 29.7%, C. baccatum과 교배한 F1은 73.5%의 높은 임성을 나타냈다. 종간잡종 F2 세대에서 저항성을 나타낸 개체와 C. baccatum간 여교잡하여 분리한 개체 중에서 탄저병에 저항성을 나타낸 18개체의 후대를 노지포장에 정식하여 탄저병 포장저항성을 평가하였다. 재배기간 중 살균제를 전혀 살포하지 않고 재배한 결과 탄저병 저항성 친으로 사용된 881045보다 저항성이 약간 낮거나 대등한 수준의 저항성을 나타낸 4계통을 선발하였다. 선발된 계통을 세대진전하여 AFLP에 의해 만들어진 다형성을 이용하여 양친 및 종간잡종 후대 62개체의 유전 조성을 비교하였다. 탄저병에 강한 저항성을 보이는 개체들은 L.F.보다 881045에 더 가까운 유전조성을 가진 것으로 나타났다. 종간잡종 후대 2계통 내 개체별 탄저병 저항성과 유전조성을 비교하였다. 그 결과 유전조성은 개체 간 차이가 거의 없음에도 불구하고 탄저병 병반의 크기는 매우 다양하게 분포하였다. 탄저병 저항성은 특정한 유전자 혹은 몇 개의 주동 유전자에 의해 좌우되는 것으로 판명되었다. C. baccatum var. pendulum과 C. annuum 간 종간잡종 후대 탄저병 저항성 계통들은 어린 유과기에서 성숙한 녹과시기까지 glucose의 함량 비율이 매우 높았다. 반면에 탄저병에 약한 품종들은 glucose의 비율이 낮고 sucrose의 비율이 높았다. 당의 종류와 탄저병 저항성과의 상관관계를 분석한 결과 glucose의 함량과 탄저병저항성은 정의 상관이 있으며, sucrose의 함량과는 부의 상관이 있었다. 재배품종으로 종간잡종 후대의 탄저병 저항성을 도입하기 위한 기초 정보를 얻기 위하여 교배효율 및 화합성을 평가하였다. 교배에 이용한 계통을 자식하고, C. annuum에 속하나 각기 유형이 다른 품종을 이용하여 F1을 작성하였다. 자가 수정할 경우 평균종자수가 종간잡종 후대 탄저병 저항성 계통은 23.5립, 재배품종은 84.7립이었다. 그러나 종간잡종 후대를 일반 재배품종과 교배한 과실의 종자(F1)수는 33.4립으로 종간잡종 후대를 자가 수정하였을 때의 종자수 보다 많았다. 이상의 결과로 보아 탄저병 저항성으로 육성된 4계통은 C. annuum에 속하는 어느 유형의 품종과 교배시에도 쉽게 후대를 얻을 수 있어 앞으로 탄저병 저항성 우량 품종 육성에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 본다. 종간 잡종 유래 고추 탄저병 저항성 계통의 탄저병 저항성 유전양식을 조사하기 위하여, 종간 잡종 유래 고추 탄저병 저항성 계통과 C. annuum에 속하는 두 품종 간에 작성된 F1 조합의 탄저병 저항성을 평가하였다. F1 조합별로 90%, 71.4%가 탄저병이 발병하였고, 병반길이는 감수성 친과 비슷하거나 더 심하게 나타났다. 두 조합 모두가 탄저병에 약한 것으로 나타나 C. baccatum var. pendulum의 탄저병 저항성이 도입된 종간잡종 후대 계통의 탄저병 저항성 유전양식은 열성유전으로 판단되었다. 그리고 881045과 같은 종에 속하면서 탄저병에 약한 특징을 가지고 있는 ‘Golden Aji'와 교배하여 분리한 F2 세대 223개체의 탄저병 저항성을 조사하였다. 평가된 집단의 7.1%의 개체가 저항성 친 881045과 비슷한 수준의 저항성을 나타냈다. 그리고 전체의 67.7%는 감수성친으로 사용된 'Golden Aji'보다 저항성이 약한 것으로 나타나 열성 유전자임을 암시해 주고 있다. 종간잡종 유래 탄저병 저항성 계통이 나타내는 저항성 기작을 이해하기 위해서 저항성 개체와 감수성 개체에 탄저병을 접종하고 저항성 개체에서만 독특하게 발현되거나 현저하게 크게 발현되는 유전자(DEGs)를 탐색하였다. DEGs의 탐색에는 dT-ACP2(reverse primer)와 120개의 arbitrary ACPs (forward primer)를 조합하여 사용하는 GeneFishingTM DEG kits를 이용한 ACP-based PCR 방법을 이용하였다. 감수성 계통과는 다르게 탄저병 저항성 계통에서 특이적으로 또는 현저하게 높게 발현된 cDNA band 23개가 전개되었다. Differentially expressed cDNAs에 대한 서열 분석 결과 5개의 DEG이 NCBI GenBank에 알져져 있는 유전자의 coding region과 매우 유사한 것으로 밝혀졌다. GP26, GP71, GP80, GP92, 그리고 GP108의 서열은 각기 72, 71, 66, 75, 그리고 76% 정도의 homology로 S-adenosyl methionine synthase I, Snakin2, DDI1, tryptophan synthase 2 beta chain, 그리고 pepper mild mottle virus와 동일한 것으로 나타났다. 9개 DEGs의 cDNA 서열은 정확한 기능은 밝혀지지 않았으나 hypothetical 단백질과 동일성을 나타냈다. 이 결과에 의하면 종간잡종 유래 계통은 탄저병균의 침입에 대항하여 과민성반응에 의해 탄저병균의 증식을 억제하는 기작을 가지고 있는 것으로 추정된다. 그리고 항균물질의 합성, 손상된 DNA 복구 및 아미노산과 단백질의 합성 강화, 그리고 스트레스에 대한 저항성이 향상된 것으로 밝혀졌다. 마지막으로 DEGs 탐색을 통해서 아직까지 전혀 알려지지 않았던 탄저병 저항성 발현 관련 단백질 유전자를 5개 찾을 수 있었다. As a major ingredient in making kimchi and gochujang (chili paste), chili pepper has been widely cultivated as one of the main spice plants in Korea. It is one of the most important agricultural commodities next to rice in terms of farm household's income. Anthracnose disease, one of the limiting factors together with late blight disease in pepper production in Korea, has increased its level of damage every year. Considering the long life-span of the plant, breeding resistant varieties has been considered the most effective and economic way to controlthis disease. This study was undertaken to find anthracnose-resistant breeding materials by evaluating various pepper germplasm by artificial inoculation, and to introduce the resistance found in Capsicum baccatum var. pendulum into C. annuum, one of the cultivated species. An attempt was also made to find genes differentially expressed in the resistant progenies derived from interspecific hybrid between C. baccatum var. pendulum and C. annuum. A total of 1,222 accessions of pepper germplasm were screened for resistance against anthracnose. Of the 1,222 accessions screened, 1,169 accessions (95.7%) belonged to C. annuum, and the rest were wild Capsicum species. Seven accessions of C. baccatum var. pendulum and one accession of C. chinense were selected for anthracnose resistance. As no accession was selected among C. annuum, it was concluded that anthracnose resistance is found only in the wild species of Capsicum. To introduce the anthracnose-resistant gene(s) into cultivated pepper, 881045, one of the C. baccatum var. pendulum selected for resistance against anthracnose, was crossed to five cultivars of C. annuum. As a result, 9 interspecific fertile plants were obtained, and 3 resistant plants were selected in F2 generation. A backcross, BC1F1 , was made between a selected resistant plant in F2 and 881045, and subsequent generations to BC1F5 generation were developed. The interspecific hybrid had yellow-green spots on petals. This characteristic is a distinctive morphological trait of C. baccatum. The plant was bigger than its parents, and the leaf shape index was similar to that of the C. baccatum parent. The length and width of petals and petiole diameter were medium in size compared with its parents. Twenty-four F2 plants were obtained from the interspecific hybrid, but only three plants were fertile. The fertile F2 plants were all anthracnose resistant. A total of 10 BC1F1 plants were also obtained from a cross between the interspecific hybrid as the seed parent and C. annuum. All of the BC1F1 plants were sterile and only one out of the 10 plants was resistant to anthracnose. Selected anthracnose-resistant F2 plants were crossed with C. annuum cultivars by using either male or female parent. Fertility of the obtained F1s was 10.5%-14%, whereas fertility was considerably high in the backcrossed progenies obtained from crosses between the selected F2 plant and either parent used in making original interspecific hybrid (BC1F1 hereafter). A high fertility of 73.5% was obtained when the F2 plant was crossed to 881045, and 29.7% fertility was observed in the cross of the F2 plant and C. annuum L.F.. Anthracnose-resistant plants were selected from the progeny of the cross between the selected F2 plant and 881045. The progenies of thus selected 18 plants were further evaluated for anthracnose resistance in open-field conditions without chemical spraying. Four lines with comparable resistance as 881045 or a little less resistance to anthracnose were selected and advanced for higher generations. Sixty-two plants including the progenies derived from the four selected lines and parents were compared for genetic composition as characterized by the amplified fragment length polymorphism (AFLP). DNA composition of anthracnose-resistant plants was more similar to that of C. baccatum var. pendulum 881045 than that of C. annuum L.F.. The DNA composition and the lesion diameter developed after artificial inoculation was compared in two selected lines derived from interspecific hybrid. The lesion diameter varied widely, despite similar DNA composition of the individual plants. It was postulated that resistance against anthracnose is regulated by a specific gene or a few major genes. The anthracnose-resistant lines from interspecific hybrid showed high glucose content in fruits, but susceptible cultivars showed higher sucrose content than glucose. Based on the Pearson correlation coefficients analysis, the lesion diameter was negatively correlated to the glucose content of the fruits, whereas it was positively correlated to the sucrose content. To obtain basic information in introducing anthracnose resistance into cultivated pepper, cross compatibility and cross efficiency were evaluated in the developed anthracnose-resistant lines from interspecific hybrid. The cross compatibility was compared in F1s as expressed by the number of seed setting. The seed count after selfing was 23.5 in the interspecific lines and 84.7 in commercial cultivars. The seed count was as high as 33.4 in hybrids between the interspecific lines and commercial cultivars. This seed count was significantly higher than the number of selfed-seeds of interspecific hybrids. Therefore, the four breeding lines developed in this study could be efficiently used for introgression of anthracnose-resistant gene(s) into various types of cultivars belonging to C. annuum. To elucidate the inheritance mode of anthracnose resistance from interspecific hybrid, resistance against anthracnose of two F1 combinations between interspecific hybrid lines and cultivars of C. annuum was evaluated by artificial inoculation. The percent infection in two F1 combinations was 90% and 71.4%, respectively, and the lesion diameter was equal to or slightly smaller than that of the susceptible parents. As both F1 combinations were susceptible to anthracnose, the resistance in the interspecific hybrid lines was postulated as a recessively inherited trait. A similar study was conducted in an F2 progeny of 223 plants derived from a cross between two lines of C. baccatum var. pendulum, a resistant line 881045 and a susceptible line 'Golden Aji'. A small number of plants, 7.1%, were classified as resistant as similar level of 881045, and 67.7% of the F2 individuals were susceptible. This result supported the hypothesis that recessive gene(s) control the resistance. To characterize the mechanism of resistant gene(s) derived from interspecific hybrid lines in the molecular level, the specifically or differentially expressed genes in the resistant or susceptible plants after artificial inoculation were screened. Differentially expressed genes (DEG) identified by a combination of dT-ACP2 (reverse primer) and 120 arbitrary ACP primers (forward primer) were detected by ACP-based PCR method through the GeneFishingTM DEG kits. Twenty-three differentially expressed cDNA bands appeared on the anthracnose-resistant lines, whereas no band was developed in susceptible lines. By sequence analysis of the differentially expressed cDNAs, five DEGs were matched with sequences in NCBI GenBank databases with high homology. Nine other DEGs were matched with hypothetical proteins with unknown functions of highly significant homology. GP26 sequence is matched to the S-adenosyl methionine synthase I with 72% homology, GP71 with Snakin2 with 71%homology, GP80 with DDI1 with 66% homology, GP92 with tryptophan synthase 2 beta chain sequence with 75% homology, and GP108 with pepper mild mottle virus sequence with 76%. In summary, DEG results showed that the hypersensitive reaction of the interspecific hybrid lines against anthracnose might be caused by a series of molecular biological mechanism responding to the invasion and multiplication of the anthracnose fungi. It was found in the study that the synthesis of antimicrobial components, amino acids and proteins, repair mechanism of damaged DNA, and adaptation to stress followed by the invasion of fungus were all enhanced. With these results, further analysis of all detected DEGs is needed to understand fully the mechanisms of the resistant and/or susceptible gene(s) responsible for the anthracnose resistance in pepper.
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