양식 바지락 (Ruditapes philippinarum)의 Perkinsus sp.와 Vibrio tapetis 감염상황 및 PCR법에 의한 검출 Perkinsus sp. and Vibrio tapetis infections in Manila clams (Ruditapes philippinarum) and PCR assay for their detection원문보기
2001년 12월부터 2003년 9월 까지 충남 태안과 전북 고창지역에서 채취한 양식 바지락을 대상으로 Perkinsus sp.와 Vibrio tapetis의 감염상황을 조사하고 신속진단을 위한 PCR법을 개발하였다. Perkinsus sp. 감염상황은 조직도말표본의 Hemocolor염색, 병리조직학적 검사 및 FTM 배양에 의해 조직별, 계절별의 변화를 조사하였다. 한편 V. tapetis의 감염상황을 조사하기 위하여 양식장 해수, 저질 및 바지락에서의 생균수 및 Vibrio균수를 조사하였으며, V, tapetis의 분리를 위해 marine ...
2001년 12월부터 2003년 9월 까지 충남 태안과 전북 고창지역에서 채취한 양식 바지락을 대상으로 Perkinsus sp.와 Vibrio tapetis의 감염상황을 조사하고 신속진단을 위한 PCR법을 개발하였다. Perkinsus sp. 감염상황은 조직도말표본의 Hemocolor염색, 병리조직학적 검사 및 FTM 배양에 의해 조직별, 계절별의 변화를 조사하였다. 한편 V. tapetis의 감염상황을 조사하기 위하여 양식장 해수, 저질 및 바지락에서의 생균수 및 Vibrio균수를 조사하였으며, V, tapetis의 분리를 위해 marine agar (Difco)에 1% mannitol (W/V), 1% bromthymol blue를 첨가하여 평판을 만든 다음 균을 접종하여 20℃에 일주일간 배양한 후 mannitol의 비분해 때문에 형성되는 푸른색의 띠를 가진 녹색 집락의 분리를 시도하였다. 해수 및 바지락에서의 우점종과 V. tapetis를 바지락에 인위 감염시켜 병원성을 조사하였다. 또 Brown ring disease (BRD)의 표준균주인 V. tapetis (NCIMB 13622)를 인위 감염시킨 바지락의 혈청 라이소자임, 혈구의 탐식능 및 혈구의 경시적 변화를 조사하여 V. tapetis에 대한 저항성을 평가하였다. PCR법에 의한 진단은 Perkinsus atlanticus genomic DNA (Accession number, AJ238400)의 5S RNA와 V. tapetis genomic DNA (Accession number, AY129278)의 16S RNA에서 조합한 primer sets를 이용하여 현장조사를 하였으며, 그 결과를 종래의 진단방법과 비교하였다. Perkinsus sp.의 감염률은 태안과 고창 지역에서 채취한 바지락 조직의 Hemacolor 염색, 병리조직학적 검사 및 FTM 배양법의 검출방법에 따라 차이가 있었다. 조직별 감염률은 지역적으로 차이가 있었지만 항상 아가미에서 높게 나타났으며, 계절별 감염률은 태안 지역은 동계에 낮아지고 하계에 증가되는 경향으로 연중 20~70%의 감염률을 나타내었지만, 고창 지역은 2002년부터 계절적 변동 없이 연중 100%의 감염률을 나타내었다. 양식장 해수, 저질과 바지락의 생균수를 조사한 결과 Vibrio와 Aeromonas균이 최우점종으로 분리되었다. 분리된 Vibrio균 중 해수에서는 Vibrio parahaemolyticus, 저질에서는 Vibrio fluvialis, 바지락에서는 Vibrio splendidus Ⅱ가 우점종이었으며, BRD의 원인균인 V. tapetis는 분리되지 않았다. 해수와 바지락의 우점종인 V. parahaemolyticus와 V. splendidus Ⅱ 및 V. tapetis를 인위 감염시킨 바지락의 폐사율을 조사하였다. V. parahaemolyticus 접종군은 고농도에서는 고수온일수록 폐사율이 높은 반면 저수온에서는 저농도에서도 폐사율이 높았다. V. splendidus Ⅱ 접종군은 고수온과 저수온 모두에서 폐사율이 높았다. V. tapetis 접종군의 폐사율은 고농도에서는 67.5%, 저농도에서는 7.5%에 불과하였으며, BRD의 특징적인 증상인 패각 내면의 chonchiolin 침착에 의한 갈색반점도 관찰되지 않았다. V. tapetis를 인위 감염시킨 바지락의 혈청 라이소자임 활성은 균 접종 1일 후부터 현저하게 감소하였으며, 혈구의 탐식율과 탐식지수는 시간이 경과할수록 현저히 감소하였으며 평균 탐식지수는 1.7이었다. 한편 균 접종 후 7일 까지 과립구의 비율은 감소하고 무과립구는 증가하는 경향이었다. Perkinsus sp.의 Pk5S (5'-cgt cga ata cac cgg at- 3', 5'-tag tcc act aga gag c-3')와 V. tapetis의 VtF (5'-aac gag aag tag ctt gct ac-3'), VtR (5'-ggt gta cgt taa cgt g-3')의 primer sets를 이용하여 바지락의 아가미에서 분리한 DNA와 PCR 반응을 시킨 결과 각각 379 bp와 414 bp의 특이밴드가 확인되었다. Perkinsus sp.의 PCR 산물염기서열 분석에서 Perkinsus atlanticus의 5S ribosomal RNA gene과 100% 상동성을 나타내었다. V. tapetis의 PCR산물은 V. tapetis와 유사성이 높은 10종의 Vibrio균을 사용하여 특이성을 검정한 결과 오직 V. tapetis에 대해서만 414 bp의 특이밴드가 확인되었다. 2004년 4월부터 7월까지 태안과 고창 지역에 분포하고 있는 동죽, 바지락, 굴 및 피뿔고둥의 아가미에서 DNA를 추출하여 두 병원체를 탐지하기 위한 PCR 반응을 시킨 결과 Perkinsus sp.와 V. tapetis가 검출되었다. 2지역의 평균 감염률을 보면 Perkinsus sp.는 바지락이 95.0%, 굴은 10.0%, 동죽은 62.5%, 피뿔고둥은 46.9%로 나타났고, V. tapetis에서는 굴이 23.1%, 동죽이 9.4% 검출되었으며 바지락과 피뿔고둥에서는 검출되지 않았다. 2004년 인천 지역에서 발과 외투막이 수축되며 대량 폐사한 바지락의 조직 도말표본과 병리조직표본에 의한 검사한 결과 미잠입 개체는 100%, 잠입개체는 80%의 감염이 확인되었다. V. tapetis는 보통의 한천평판 배양법으로는 분리되지 않았다. 그러나 PCR법에 의한 검출에서 Perkinsus sp.는 미잠입 개체에서는 3개체 모두에서, 잠임개체에서는 4개체 중 3개체에서 감염이 확산되었다. 한편 V. tapetis의 경우에는 미잠입 개체에서는 3개체 모두에서, 잠입개체는 4개체 중 1개체에서 감염이 확인되었다. 이러한 결과를 종합하면 서해안 바지락 양식장에는 Perkinsus sp.와 V. tapetis가 만연되어 있는 것으로 확인되었다. Perkinsus sp.의 감염률 조사에는 재래적 방법 중에서 병리조직학적 방법이 가장 효과적이었고 검출 조직은 아가미가 가장 효과적이었으며, PCR법에 의한 검출율과 비교하면 차이가 없었다. 그러나 V. tapetis균은 보통의 배양학적 방법으로는 분리되지 않았으나 PCR법으로는 감염이 확인되어 BRD의 진단에는 PCR법이 효과적인 것으로 판명되었다.
2001년 12월부터 2003년 9월 까지 충남 태안과 전북 고창지역에서 채취한 양식 바지락을 대상으로 Perkinsus sp.와 Vibrio tapetis의 감염상황을 조사하고 신속진단을 위한 PCR법을 개발하였다. Perkinsus sp. 감염상황은 조직도말표본의 Hemocolor염색, 병리조직학적 검사 및 FTM 배양에 의해 조직별, 계절별의 변화를 조사하였다. 한편 V. tapetis의 감염상황을 조사하기 위하여 양식장 해수, 저질 및 바지락에서의 생균수 및 Vibrio균수를 조사하였으며, V, tapetis의 분리를 위해 marine agar (Difco)에 1% mannitol (W/V), 1% bromthymol blue를 첨가하여 평판을 만든 다음 균을 접종하여 20℃에 일주일간 배양한 후 mannitol의 비분해 때문에 형성되는 푸른색의 띠를 가진 녹색 집락의 분리를 시도하였다. 해수 및 바지락에서의 우점종과 V. tapetis를 바지락에 인위 감염시켜 병원성을 조사하였다. 또 Brown ring disease (BRD)의 표준균주인 V. tapetis (NCIMB 13622)를 인위 감염시킨 바지락의 혈청 라이소자임, 혈구의 탐식능 및 혈구의 경시적 변화를 조사하여 V. tapetis에 대한 저항성을 평가하였다. PCR법에 의한 진단은 Perkinsus atlanticus genomic DNA (Accession number, AJ238400)의 5S RNA와 V. tapetis genomic DNA (Accession number, AY129278)의 16S RNA에서 조합한 primer sets를 이용하여 현장조사를 하였으며, 그 결과를 종래의 진단방법과 비교하였다. Perkinsus sp.의 감염률은 태안과 고창 지역에서 채취한 바지락 조직의 Hemacolor 염색, 병리조직학적 검사 및 FTM 배양법의 검출방법에 따라 차이가 있었다. 조직별 감염률은 지역적으로 차이가 있었지만 항상 아가미에서 높게 나타났으며, 계절별 감염률은 태안 지역은 동계에 낮아지고 하계에 증가되는 경향으로 연중 20~70%의 감염률을 나타내었지만, 고창 지역은 2002년부터 계절적 변동 없이 연중 100%의 감염률을 나타내었다. 양식장 해수, 저질과 바지락의 생균수를 조사한 결과 Vibrio와 Aeromonas균이 최우점종으로 분리되었다. 분리된 Vibrio균 중 해수에서는 Vibrio parahaemolyticus, 저질에서는 Vibrio fluvialis, 바지락에서는 Vibrio splendidus Ⅱ가 우점종이었으며, BRD의 원인균인 V. tapetis는 분리되지 않았다. 해수와 바지락의 우점종인 V. parahaemolyticus와 V. splendidus Ⅱ 및 V. tapetis를 인위 감염시킨 바지락의 폐사율을 조사하였다. V. parahaemolyticus 접종군은 고농도에서는 고수온일수록 폐사율이 높은 반면 저수온에서는 저농도에서도 폐사율이 높았다. V. splendidus Ⅱ 접종군은 고수온과 저수온 모두에서 폐사율이 높았다. V. tapetis 접종군의 폐사율은 고농도에서는 67.5%, 저농도에서는 7.5%에 불과하였으며, BRD의 특징적인 증상인 패각 내면의 chonchiolin 침착에 의한 갈색반점도 관찰되지 않았다. V. tapetis를 인위 감염시킨 바지락의 혈청 라이소자임 활성은 균 접종 1일 후부터 현저하게 감소하였으며, 혈구의 탐식율과 탐식지수는 시간이 경과할수록 현저히 감소하였으며 평균 탐식지수는 1.7이었다. 한편 균 접종 후 7일 까지 과립구의 비율은 감소하고 무과립구는 증가하는 경향이었다. Perkinsus sp.의 Pk5S (5'-cgt cga ata cac cgg at- 3', 5'-tag tcc act aga gag c-3')와 V. tapetis의 VtF (5'-aac gag aag tag ctt gct ac-3'), VtR (5'-ggt gta cgt taa cgt g-3')의 primer sets를 이용하여 바지락의 아가미에서 분리한 DNA와 PCR 반응을 시킨 결과 각각 379 bp와 414 bp의 특이밴드가 확인되었다. Perkinsus sp.의 PCR 산물염기서열 분석에서 Perkinsus atlanticus의 5S ribosomal RNA gene과 100% 상동성을 나타내었다. V. tapetis의 PCR산물은 V. tapetis와 유사성이 높은 10종의 Vibrio균을 사용하여 특이성을 검정한 결과 오직 V. tapetis에 대해서만 414 bp의 특이밴드가 확인되었다. 2004년 4월부터 7월까지 태안과 고창 지역에 분포하고 있는 동죽, 바지락, 굴 및 피뿔고둥의 아가미에서 DNA를 추출하여 두 병원체를 탐지하기 위한 PCR 반응을 시킨 결과 Perkinsus sp.와 V. tapetis가 검출되었다. 2지역의 평균 감염률을 보면 Perkinsus sp.는 바지락이 95.0%, 굴은 10.0%, 동죽은 62.5%, 피뿔고둥은 46.9%로 나타났고, V. tapetis에서는 굴이 23.1%, 동죽이 9.4% 검출되었으며 바지락과 피뿔고둥에서는 검출되지 않았다. 2004년 인천 지역에서 발과 외투막이 수축되며 대량 폐사한 바지락의 조직 도말표본과 병리조직표본에 의한 검사한 결과 미잠입 개체는 100%, 잠입개체는 80%의 감염이 확인되었다. V. tapetis는 보통의 한천평판 배양법으로는 분리되지 않았다. 그러나 PCR법에 의한 검출에서 Perkinsus sp.는 미잠입 개체에서는 3개체 모두에서, 잠임개체에서는 4개체 중 3개체에서 감염이 확산되었다. 한편 V. tapetis의 경우에는 미잠입 개체에서는 3개체 모두에서, 잠입개체는 4개체 중 1개체에서 감염이 확인되었다. 이러한 결과를 종합하면 서해안 바지락 양식장에는 Perkinsus sp.와 V. tapetis가 만연되어 있는 것으로 확인되었다. Perkinsus sp.의 감염률 조사에는 재래적 방법 중에서 병리조직학적 방법이 가장 효과적이었고 검출 조직은 아가미가 가장 효과적이었으며, PCR법에 의한 검출율과 비교하면 차이가 없었다. 그러나 V. tapetis균은 보통의 배양학적 방법으로는 분리되지 않았으나 PCR법으로는 감염이 확인되어 BRD의 진단에는 PCR법이 효과적인 것으로 판명되었다.
Perkinsus sp. and Vibrio tapetis infections of Manila clam (Ruditapes philippinarum) were investigated with some conventional methods such as Hemacolor stain, histopathological observations and FTM assay for Perkinsus sp. and cultivation on agar plates for V. tapetis from December 2001 to september ...
Perkinsus sp. and Vibrio tapetis infections of Manila clam (Ruditapes philippinarum) were investigated with some conventional methods such as Hemacolor stain, histopathological observations and FTM assay for Perkinsus sp. and cultivation on agar plates for V. tapetis from December 2001 to september 2003. PCR assay for their detection were developed and compared with the conventional methods. Numbers of viable cells, Vibrio species and V. tapetis, the causative organism of brown ring disease (BRD), in seawater, sediment and various tissues of Manila clam were counted on agar plates. A selective medium, marine agar (Difco) with 1% mannitol (w/v) and 1% bromthymol blue was applied for the isolation of V. tapetis. V. tapetis form bluish green colonies with halo because the bacteria can't utilize mannitol in the medium for their energy source. Pathogenicity of V. tapetis and dominant Vibrio species from seawater and Manila clam tissues were examined by artificially injecting them to Manila clam. Resistance of Manila clam against V. tapetis (NCIMB 13622) was also evaluated by checking activity of lysozyme in hemolymph, phagocytic activity of hemocytes and change of hemocytes composition. PCR assay was established by primer sets, which were partial sequences of 5S RNA of Perkinsus atlanticus genomic DNA (Accession number, AJ238400) and 16S RNA of V. tapetis genomic DNA (Accession number, AY129278) and compared with existing methods using for the detection of Perkinsus sp. and V. tapetis. Infection rates of Perkinsus sp. in Taean and Gochang Manila clam were different in different methods and the locality of the specimens. The infection rate in gills was always much higher than those in other clam tissues. The rate had a tendency decreasing during winter and increasing during summer. The rate was 20~70% all the year round in Taean and 100% from 2002 in Gochang. Vibrio and Aeromonas were always dominant bacterial species in seawater, sediment and Manila clam tissues. Dominant Vibrio species in seawater, sediment and Manila clam tissues were V. parahaemolyticus, V. fluvialis, and V. splendidus Ⅱ, respectively. But V. tapetis, the causative agent of BRD, couldn't be isolated by incubation on agar plates. Accumulated mortality of Manila clam artificially injected with V. parahaemolyticus, V. splendidus Ⅱ and V. tapetis was investigated. The high temperature and bacterial concentrations of V. parahaemolyticus were the higher virulence was but the virulence was still high in spite of the low bacterial concentration at 20℃. V. splendidus Ⅱ showed the same degree of pathogenicity as in V. parahaemolyticus. Accumulated mortality of Manila clams injected with V. tapetis was 67.5% at high bacterial concentration and 7.5% at low bacterial concentration. But any deposit of brown pigment was not observed in inner shells of the V. tapetis-injected clams. Lysozomal activity of Manila clam injected with V. tapetis (NCIMB 13622) was rapidly decreased one day after the injection. Phagocytic activities of phagocytes in Manila clam injected with V. tapetis were considerably decreased comparing with those in control clams. Granulocytes were decreased but hyalinocytes namely agranulocytes increased 7 days after the injection of V. tapetis. For development of PCR assay, with Pk5S (5'-cgt cga ata cac cgg at-3', 5'-tag tcc act aga gag c-3') and Vt (5'-aac gag aag ctt ac-3', 5'-ggt gta cgt taa tag cgt g-3') primer sets that were designed for Perkinsus sp. and V. tapetis we each got 379 bp and 414 bp PCR products amplified from DNA template of Manila clam gill tissue. The nucleotide sequences of the PCR products showed 100% identity with those of Perkinsus atlanticus 5S ribosomal RNA gene. When the specificity of PCR assay for the detection of V. tapetis was evaluated using DNA templates from 10 different species of Vibrio, Only a specific band of 414 bp was detected in V. tapetis. Gill was the most suitable tissue for the detection of Perkinsus sp. and V. tapetis by PCR assay. When PCR assay was applied for detection of Perkinsus sp. and V. tapetis in Surf clam (Mectra veneriformis), Manila clam, oyster (Crassostrea gigas) and Thomas's rapa whelk (Rapana venosa) taken from the same areas of Taean and Gochang from April to July 2004. Perkinsus sp. was detected from all the samples and the infection rates were 95%, 10%, 62.5% and 46.9% in Manila clam, oyster, Surf clam and Thomas's rapa whelk, respectively. Infection rates of V. tapetis were 23.1% and 9.4% in oyster and Surf clam. But V. tapetis was not detected from Manila clam and Thomas's rapa whelk. The diseased Manila clams from Incheon coastal area where mass mortality was occurred in 2004 showed atrophied foot and mantle. When the clams were divided into two groups, surfacing and burrowing ones and Perkinsus sp. in them was detected by Hemacolor stain and histopathological observation, the infection rate was 100% in surfacing group and 80% in burrowing group. V. tapetis was not isolated even though application of the selective agar plates for the bacterium. But Perkinsus sp. was detected in all surfacing and burrowing Manila clams. In conclusion, Perkinsus sp. and V. tapetis were proven to be widespread in culturing beds for Manila clams in the west coastal area of Korea. Histopathological observation was the most effective in investigation of Perkinsus sp. infection, which wasn't different from the results using by PCR assay. V. tapetis was not isolated by bacterial incubation on agar plates but detected by PCR assay. PCR assay to detect V. tapetis was proven to be effective.
Perkinsus sp. and Vibrio tapetis infections of Manila clam (Ruditapes philippinarum) were investigated with some conventional methods such as Hemacolor stain, histopathological observations and FTM assay for Perkinsus sp. and cultivation on agar plates for V. tapetis from December 2001 to september 2003. PCR assay for their detection were developed and compared with the conventional methods. Numbers of viable cells, Vibrio species and V. tapetis, the causative organism of brown ring disease (BRD), in seawater, sediment and various tissues of Manila clam were counted on agar plates. A selective medium, marine agar (Difco) with 1% mannitol (w/v) and 1% bromthymol blue was applied for the isolation of V. tapetis. V. tapetis form bluish green colonies with halo because the bacteria can't utilize mannitol in the medium for their energy source. Pathogenicity of V. tapetis and dominant Vibrio species from seawater and Manila clam tissues were examined by artificially injecting them to Manila clam. Resistance of Manila clam against V. tapetis (NCIMB 13622) was also evaluated by checking activity of lysozyme in hemolymph, phagocytic activity of hemocytes and change of hemocytes composition. PCR assay was established by primer sets, which were partial sequences of 5S RNA of Perkinsus atlanticus genomic DNA (Accession number, AJ238400) and 16S RNA of V. tapetis genomic DNA (Accession number, AY129278) and compared with existing methods using for the detection of Perkinsus sp. and V. tapetis. Infection rates of Perkinsus sp. in Taean and Gochang Manila clam were different in different methods and the locality of the specimens. The infection rate in gills was always much higher than those in other clam tissues. The rate had a tendency decreasing during winter and increasing during summer. The rate was 20~70% all the year round in Taean and 100% from 2002 in Gochang. Vibrio and Aeromonas were always dominant bacterial species in seawater, sediment and Manila clam tissues. Dominant Vibrio species in seawater, sediment and Manila clam tissues were V. parahaemolyticus, V. fluvialis, and V. splendidus Ⅱ, respectively. But V. tapetis, the causative agent of BRD, couldn't be isolated by incubation on agar plates. Accumulated mortality of Manila clam artificially injected with V. parahaemolyticus, V. splendidus Ⅱ and V. tapetis was investigated. The high temperature and bacterial concentrations of V. parahaemolyticus were the higher virulence was but the virulence was still high in spite of the low bacterial concentration at 20℃. V. splendidus Ⅱ showed the same degree of pathogenicity as in V. parahaemolyticus. Accumulated mortality of Manila clams injected with V. tapetis was 67.5% at high bacterial concentration and 7.5% at low bacterial concentration. But any deposit of brown pigment was not observed in inner shells of the V. tapetis-injected clams. Lysozomal activity of Manila clam injected with V. tapetis (NCIMB 13622) was rapidly decreased one day after the injection. Phagocytic activities of phagocytes in Manila clam injected with V. tapetis were considerably decreased comparing with those in control clams. Granulocytes were decreased but hyalinocytes namely agranulocytes increased 7 days after the injection of V. tapetis. For development of PCR assay, with Pk5S (5'-cgt cga ata cac cgg at-3', 5'-tag tcc act aga gag c-3') and Vt (5'-aac gag aag ctt ac-3', 5'-ggt gta cgt taa tag cgt g-3') primer sets that were designed for Perkinsus sp. and V. tapetis we each got 379 bp and 414 bp PCR products amplified from DNA template of Manila clam gill tissue. The nucleotide sequences of the PCR products showed 100% identity with those of Perkinsus atlanticus 5S ribosomal RNA gene. When the specificity of PCR assay for the detection of V. tapetis was evaluated using DNA templates from 10 different species of Vibrio, Only a specific band of 414 bp was detected in V. tapetis. Gill was the most suitable tissue for the detection of Perkinsus sp. and V. tapetis by PCR assay. When PCR assay was applied for detection of Perkinsus sp. and V. tapetis in Surf clam (Mectra veneriformis), Manila clam, oyster (Crassostrea gigas) and Thomas's rapa whelk (Rapana venosa) taken from the same areas of Taean and Gochang from April to July 2004. Perkinsus sp. was detected from all the samples and the infection rates were 95%, 10%, 62.5% and 46.9% in Manila clam, oyster, Surf clam and Thomas's rapa whelk, respectively. Infection rates of V. tapetis were 23.1% and 9.4% in oyster and Surf clam. But V. tapetis was not detected from Manila clam and Thomas's rapa whelk. The diseased Manila clams from Incheon coastal area where mass mortality was occurred in 2004 showed atrophied foot and mantle. When the clams were divided into two groups, surfacing and burrowing ones and Perkinsus sp. in them was detected by Hemacolor stain and histopathological observation, the infection rate was 100% in surfacing group and 80% in burrowing group. V. tapetis was not isolated even though application of the selective agar plates for the bacterium. But Perkinsus sp. was detected in all surfacing and burrowing Manila clams. In conclusion, Perkinsus sp. and V. tapetis were proven to be widespread in culturing beds for Manila clams in the west coastal area of Korea. Histopathological observation was the most effective in investigation of Perkinsus sp. infection, which wasn't different from the results using by PCR assay. V. tapetis was not isolated by bacterial incubation on agar plates but detected by PCR assay. PCR assay to detect V. tapetis was proven to be effective.
AI-Helper
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.