페닐케톤뇨증동물모델에서 재조합 아데노 부속바이러스 매개에 의한 유전자치료연구 페닐케톤뇨증은 페닐알라닌 수산화효소라는 효소를 만들어 내는 유전자 (12q22–24)의 이상으로 인해 발병하는 상염색체 열성 유전질환이다. 음식물을 통해 체내에 흡수되는 페닐알라닌은 필수아미노산으로써 주로 간에서 생성되는 페닐알라닌 수산화효소에의해 타이로신이라는 다른 아미노산으로 전환되어 여러 생물학적반응에서 중요한 기질로 사용된다. 그러나 페닐케톤뇨증 환자의 경우 이 페닐알라닌 수산화효소 기능이 결핍또는 불완전하여 페닐알라닌을 타이로신으로 바꾸지 못해 체내에 과량으로 페닐알라닌이 축적되고 이로인해 제2의 대사산물인 페닐피루빈산과 페닐에틸아민도 과량으로 생성된다. 현재 이 과량으로 생성되는 페닐알라닌과 이로인한 대사산물들은 정상적인 대사와 뇌의기능을 손상시키고 있는것으로 보고되고 있다. 이 질환의 환자의 경우 일반적으로 지능저하가 심하고 멜라닌 색소감소에 의한 담갈색의 머리카락과 흰 피부를 갖는 것을 특징으로 한다. 이외에도 소두증, 성장지연등이 치료받지 않은 환자들에게 흔한 소견이다. 현재 치료의 개념으로 임상에서 응용되는 치료법은 저페닐알라닌 식이요법이다. 식이요법을 성공적으로 시행하는 경우 정상적인 혈중 페닐알라닌 유지가 가능하며 이 질병에 따른 특징적인 증상이 발현되지 않는다. 하지만 이 식이요법의 경우 환자 및 가족들에게 정신적 경제적으로 큰 부담을 부여하고 있고 또 환자의 부적절한 감정상의 문제발생으로 인한 사회성결여에도 기여하는 등 여러 문제점을 안고있는 것이 현실이다. 이외에도 페닐케톤뇨증의 여자 환자가 임신한 경우 철저한 식이관리가 되지않으면 임산부의 혈류를 통해 태아에게 고농도의 페닐알라닌이 전달되어 태아의 발달에 장애가 일어나고 태아의 뇌에도 치명적인 손상을 일으킨다. 따라서 현재 유일한 치료법으로 존재하는 식이요법이라는 ...
페닐케톤뇨증동물모델에서 재조합 아데노 부속바이러스 매개에 의한 유전자치료연구 페닐케톤뇨증은 페닐알라닌 수산화효소라는 효소를 만들어 내는 유전자 (12q22–24)의 이상으로 인해 발병하는 상염색체 열성 유전질환이다. 음식물을 통해 체내에 흡수되는 페닐알라닌은 필수아미노산으로써 주로 간에서 생성되는 페닐알라닌 수산화효소에의해 타이로신이라는 다른 아미노산으로 전환되어 여러 생물학적반응에서 중요한 기질로 사용된다. 그러나 페닐케톤뇨증 환자의 경우 이 페닐알라닌 수산화효소 기능이 결핍또는 불완전하여 페닐알라닌을 타이로신으로 바꾸지 못해 체내에 과량으로 페닐알라닌이 축적되고 이로인해 제2의 대사산물인 페닐피루빈산과 페닐에틸아민도 과량으로 생성된다. 현재 이 과량으로 생성되는 페닐알라닌과 이로인한 대사산물들은 정상적인 대사와 뇌의기능을 손상시키고 있는것으로 보고되고 있다. 이 질환의 환자의 경우 일반적으로 지능저하가 심하고 멜라닌 색소감소에 의한 담갈색의 머리카락과 흰 피부를 갖는 것을 특징으로 한다. 이외에도 소두증, 성장지연등이 치료받지 않은 환자들에게 흔한 소견이다. 현재 치료의 개념으로 임상에서 응용되는 치료법은 저페닐알라닌 식이요법이다. 식이요법을 성공적으로 시행하는 경우 정상적인 혈중 페닐알라닌 유지가 가능하며 이 질병에 따른 특징적인 증상이 발현되지 않는다. 하지만 이 식이요법의 경우 환자 및 가족들에게 정신적 경제적으로 큰 부담을 부여하고 있고 또 환자의 부적절한 감정상의 문제발생으로 인한 사회성결여에도 기여하는 등 여러 문제점을 안고있는 것이 현실이다. 이외에도 페닐케톤뇨증의 여자 환자가 임신한 경우 철저한 식이관리가 되지않으면 임산부의 혈류를 통해 태아에게 고농도의 페닐알라닌이 전달되어 태아의 발달에 장애가 일어나고 태아의 뇌에도 치명적인 손상을 일으킨다. 따라서 현재 유일한 치료법으로 존재하는 식이요법이라는 삶의 질을 고려하지 않는 치료법을 대체하여 근원적인 치료효과를 거둘 수 있는 치료법의 연구가 활발하게 진행되고 있는데 그 중 하나가 유전자치료이다. 정상적인 페닐알라닌 수산화효소를 체내에 도입하는 유전자 치료 연구는 현재까지 DNA/protein complex, retrovirus 및 adenovirus를 이용하여 표적으로하는 세포 및 기관에 유전자를 도입하는 연구를 실시하였다. 그러나 앞서 기술된 방법들은 그 효율이 매우 낮거나 in vivo에서 그 효력을 장기간 지속하지 못하는 단점들이 있어서 이런 단점을 극복하고 근본적인 치료법을 개발하고자 본 연구에서는 비병원성 바이러스로써 분열하는 세포 및 간과 뇌세포와 같은 비분열 세포에도 유전자를 효율적으로 도입할 수 있으며 또한 염색체 특정 위치에 삽입되어 장기간 발현될 수 있는 등 유전자 전달 매체로서 여러 장점을 가지고 있는 아데노 부속 바이러스를 매개로 하여 동물모델에서 그 치료 효과와 안전성에 대한 연구를 수행하였다. 시험관내에서, 페닐알라닌 수산화효소의 발현여부와 활성도를 확인하고 생체내 실험을 실시한 결과 인간의 페닐케톤뇨증의 특징적인 증상들을 가장 잘 발현하고있는 질병동물모델인 PAHenu2에서 연구기간인 25주동안 성공적인 치료 결과가 관찰되었다. 바이러스 벡터를 간문맥을 통해 투여후 약 10일이 경과된 후부터 털색깔이 변하기 시작하였고 2주째에는 정상 마우스 군과 털새깔을 구분할 수 없을 정도로 검은색으로 변화되었다. 효과적인 치료여부에 대한 평가는 hypopigmentation의 교정, 간 추출물의 효소활성도 및 혈중 페닐알라닌 농도를 통해 측정하였다. 바이러스 벡터 투여후 중화항체생성 및 간독성등의 부작용은 관찰되지 않았다. 이러한 표현형적, 생화학적으로 우수한 결과들을 통해 재조합 아데노부속바이러스를 매개로하는 유전자치료는 페닐케톤뇨증 치료에 있어서 유용한 치료법이 될 수 있을것으로 사료된다. 이외에도 페닐케톤뇨증의 가장 심각한 문제인 중추신경계에도 유전자 치료가 미치는 효과에 대한 연구도 수행되었다. 혈중내 축적된 페닐알라닌에 의해 기인된 다른 증상들과는 달리 뇌에 미치는 영향은 비가역적으로 진행되어 생후 1년 이내에 치료하지 않으면 자폐아나 지능박약아가 되므로 조기 치료가 요구되는데, 유전자치료가 페닐케톤뇨증의 손상된 뇌에 어떠한 영향을 미치는지를 치료받지않는 동물모델군과의 유전자 발현 정도차를 통해 비교하였고 이를 위해 oligonucelotide array라는 기법을 이용하였다. 페닐케톤뇨증의 병적인 상태의 중추신경계에서 12개의 발현이 증가된 유전자가 확인되었고, 이 유전자들은 호중구의 염증반응과 방어기전에 연루된 유전자들과 , 세포외기질의 구성과 분해에 관련된 유전자들이 주를 이루었다. 유전자치료를 통해 혈중 페닐알라닌이 정상수준으로 회복된 후 병적인 상태의 신경계에서 이상적으로 증가되었던 유전자들이 모두 정상적으로 발현되었음이 확인되었다. 이 연구는 페닐케톤뇨증의 심각한 증상인 중추신경계의 손상에 대한 분자수준에서의 포괄적인 이해를 돕는데 유용한 정보를 제공할 뿐만 아니라 좀 더 우수한 치료법의 개발에도 기여할 수 있는 연구 결과로 사료된다.
페닐케톤뇨증 동물모델에서 재조합 아데노 부속바이러스 매개에 의한 유전자치료연구 페닐케톤뇨증은 페닐알라닌 수산화효소라는 효소를 만들어 내는 유전자 (12q22–24)의 이상으로 인해 발병하는 상염색체 열성 유전질환이다. 음식물을 통해 체내에 흡수되는 페닐알라닌은 필수아미노산으로써 주로 간에서 생성되는 페닐알라닌 수산화효소에의해 타이로신이라는 다른 아미노산으로 전환되어 여러 생물학적반응에서 중요한 기질로 사용된다. 그러나 페닐케톤뇨증 환자의 경우 이 페닐알라닌 수산화효소 기능이 결핍또는 불완전하여 페닐알라닌을 타이로신으로 바꾸지 못해 체내에 과량으로 페닐알라닌이 축적되고 이로인해 제2의 대사산물인 페닐피루빈산과 페닐에틸아민도 과량으로 생성된다. 현재 이 과량으로 생성되는 페닐알라닌과 이로인한 대사산물들은 정상적인 대사와 뇌의기능을 손상시키고 있는것으로 보고되고 있다. 이 질환의 환자의 경우 일반적으로 지능저하가 심하고 멜라닌 색소감소에 의한 담갈색의 머리카락과 흰 피부를 갖는 것을 특징으로 한다. 이외에도 소두증, 성장지연등이 치료받지 않은 환자들에게 흔한 소견이다. 현재 치료의 개념으로 임상에서 응용되는 치료법은 저페닐알라닌 식이요법이다. 식이요법을 성공적으로 시행하는 경우 정상적인 혈중 페닐알라닌 유지가 가능하며 이 질병에 따른 특징적인 증상이 발현되지 않는다. 하지만 이 식이요법의 경우 환자 및 가족들에게 정신적 경제적으로 큰 부담을 부여하고 있고 또 환자의 부적절한 감정상의 문제발생으로 인한 사회성결여에도 기여하는 등 여러 문제점을 안고있는 것이 현실이다. 이외에도 페닐케톤뇨증의 여자 환자가 임신한 경우 철저한 식이관리가 되지않으면 임산부의 혈류를 통해 태아에게 고농도의 페닐알라닌이 전달되어 태아의 발달에 장애가 일어나고 태아의 뇌에도 치명적인 손상을 일으킨다. 따라서 현재 유일한 치료법으로 존재하는 식이요법이라는 삶의 질을 고려하지 않는 치료법을 대체하여 근원적인 치료효과를 거둘 수 있는 치료법의 연구가 활발하게 진행되고 있는데 그 중 하나가 유전자치료이다. 정상적인 페닐알라닌 수산화효소를 체내에 도입하는 유전자 치료 연구는 현재까지 DNA/protein complex, retrovirus 및 adenovirus를 이용하여 표적으로하는 세포 및 기관에 유전자를 도입하는 연구를 실시하였다. 그러나 앞서 기술된 방법들은 그 효율이 매우 낮거나 in vivo에서 그 효력을 장기간 지속하지 못하는 단점들이 있어서 이런 단점을 극복하고 근본적인 치료법을 개발하고자 본 연구에서는 비병원성 바이러스로써 분열하는 세포 및 간과 뇌세포와 같은 비분열 세포에도 유전자를 효율적으로 도입할 수 있으며 또한 염색체 특정 위치에 삽입되어 장기간 발현될 수 있는 등 유전자 전달 매체로서 여러 장점을 가지고 있는 아데노 부속 바이러스를 매개로 하여 동물모델에서 그 치료 효과와 안전성에 대한 연구를 수행하였다. 시험관내에서, 페닐알라닌 수산화효소의 발현여부와 활성도를 확인하고 생체내 실험을 실시한 결과 인간의 페닐케톤뇨증의 특징적인 증상들을 가장 잘 발현하고있는 질병동물모델인 PAHenu2에서 연구기간인 25주동안 성공적인 치료 결과가 관찰되었다. 바이러스 벡터를 간문맥을 통해 투여후 약 10일이 경과된 후부터 털색깔이 변하기 시작하였고 2주째에는 정상 마우스 군과 털새깔을 구분할 수 없을 정도로 검은색으로 변화되었다. 효과적인 치료여부에 대한 평가는 hypopigmentation의 교정, 간 추출물의 효소활성도 및 혈중 페닐알라닌 농도를 통해 측정하였다. 바이러스 벡터 투여후 중화항체생성 및 간독성등의 부작용은 관찰되지 않았다. 이러한 표현형적, 생화학적으로 우수한 결과들을 통해 재조합 아데노부속바이러스를 매개로하는 유전자치료는 페닐케톤뇨증 치료에 있어서 유용한 치료법이 될 수 있을것으로 사료된다. 이외에도 페닐케톤뇨증의 가장 심각한 문제인 중추신경계에도 유전자 치료가 미치는 효과에 대한 연구도 수행되었다. 혈중내 축적된 페닐알라닌에 의해 기인된 다른 증상들과는 달리 뇌에 미치는 영향은 비가역적으로 진행되어 생후 1년 이내에 치료하지 않으면 자폐아나 지능박약아가 되므로 조기 치료가 요구되는데, 유전자치료가 페닐케톤뇨증의 손상된 뇌에 어떠한 영향을 미치는지를 치료받지않는 동물모델군과의 유전자 발현 정도차를 통해 비교하였고 이를 위해 oligonucelotide array라는 기법을 이용하였다. 페닐케톤뇨증의 병적인 상태의 중추신경계에서 12개의 발현이 증가된 유전자가 확인되었고, 이 유전자들은 호중구의 염증반응과 방어기전에 연루된 유전자들과 , 세포외기질의 구성과 분해에 관련된 유전자들이 주를 이루었다. 유전자치료를 통해 혈중 페닐알라닌이 정상수준으로 회복된 후 병적인 상태의 신경계에서 이상적으로 증가되었던 유전자들이 모두 정상적으로 발현되었음이 확인되었다. 이 연구는 페닐케톤뇨증의 심각한 증상인 중추신경계의 손상에 대한 분자수준에서의 포괄적인 이해를 돕는데 유용한 정보를 제공할 뿐만 아니라 좀 더 우수한 치료법의 개발에도 기여할 수 있는 연구 결과로 사료된다.
Phenylketonuria (PKU) is an autosomal recessive metabolic disorder caused by a deficiency of phenylalanine hydroxylase (PAH). The accumulation of phenylalanine leads to severe mental and psychomotoric retardation, and hypopigmentation of skin and hair. Low-phenylalanine diet therapy can prevent irre...
Phenylketonuria (PKU) is an autosomal recessive metabolic disorder caused by a deficiency of phenylalanine hydroxylase (PAH). The accumulation of phenylalanine leads to severe mental and psychomotoric retardation, and hypopigmentation of skin and hair. Low-phenylalanine diet therapy can prevent irreversible damage if instituted from birth. However, poor compliance to the strict life-long dietary therapy leads to various neurological and behavioral problems. To develop a safe and promising gene therapy method for PKU, I investigated whether a recombinant adeno-associated virus could be used as a PAH gene transfer vector to reduce the excessive phenylalanine level in the PKU mouse model. A recombinant adeno-associated virus vector encoding the human PAH gene (rAAV-hPAH), driven by EF1-a promoter, was infused into PAH-deficient mice, Pahenu2, via the hepatic portal vein. Two weeks after injection, the plasma phenylalanine level dramatically decreased to 360 mM in male PKU mice, accompanied by the coat color changing to black. The mean plasma phenylalanine level of untreated PKU mice was 1800 mM. The PAH enzyme activities of treated mice increased to 10–17 % of wild-type mice. No signs of liver toxicity were observed after gene transfer. The biochemical and phenotypic corrections were sustained for up to 25 weeks (25-week detection period). In contrast, the treatment was less effective in female PKU mice. These results indicate that recombinant adeno-associated virus vector mediated gene therapy can be a useful therapeutic candidate for patients with PKU. Subsequently, I identified the expression of genes related to pathologic abnormalities of the PKU-affected brain, in which the symptoms of PKU are mainly manifest, and transcriptional changes in effective gene therapy treatment using oligonucleotide array. My data indicated that twelve genes were significantly up regulated in PKU. Four are involved in defense and inflammatory responses of neutrophils (NE, MPO, NGP, and CRAMP), three other overexpressed genes are related to extracellular matrix organization and degradation (COL1A1, COL1A2 and MMP13); the remainder were a nociceptor in sensory neurons (MrgA1), a structural gene of P lysozyme (Lzp-s), an immunoglobulin alpha heavy chain constant region gene (Igh-2), an osteocalcin-related protein precursor (Bglap-rs1), and a membrane-spanning 4 domain, subfamily A, member 3 (Ms4a3). Data demonstrated that elevated genes in the PKU-affected brain could be normalized by human PAH gene delivery. Although I could not precisely link transcript level changes and neurologic pathogenesis, this study provides a more comprehensive understanding of the PKU-affected brain at the molecular level, possibly resulting in better therapeutic approaches.
Phenylketonuria (PKU) is an autosomal recessive metabolic disorder caused by a deficiency of phenylalanine hydroxylase (PAH). The accumulation of phenylalanine leads to severe mental and psychomotoric retardation, and hypopigmentation of skin and hair. Low-phenylalanine diet therapy can prevent irreversible damage if instituted from birth. However, poor compliance to the strict life-long dietary therapy leads to various neurological and behavioral problems. To develop a safe and promising gene therapy method for PKU, I investigated whether a recombinant adeno-associated virus could be used as a PAH gene transfer vector to reduce the excessive phenylalanine level in the PKU mouse model. A recombinant adeno-associated virus vector encoding the human PAH gene (rAAV-hPAH), driven by EF1-a promoter, was infused into PAH-deficient mice, Pahenu2, via the hepatic portal vein. Two weeks after injection, the plasma phenylalanine level dramatically decreased to 360 mM in male PKU mice, accompanied by the coat color changing to black. The mean plasma phenylalanine level of untreated PKU mice was 1800 mM. The PAH enzyme activities of treated mice increased to 10–17 % of wild-type mice. No signs of liver toxicity were observed after gene transfer. The biochemical and phenotypic corrections were sustained for up to 25 weeks (25-week detection period). In contrast, the treatment was less effective in female PKU mice. These results indicate that recombinant adeno-associated virus vector mediated gene therapy can be a useful therapeutic candidate for patients with PKU. Subsequently, I identified the expression of genes related to pathologic abnormalities of the PKU-affected brain, in which the symptoms of PKU are mainly manifest, and transcriptional changes in effective gene therapy treatment using oligonucleotide array. My data indicated that twelve genes were significantly up regulated in PKU. Four are involved in defense and inflammatory responses of neutrophils (NE, MPO, NGP, and CRAMP), three other overexpressed genes are related to extracellular matrix organization and degradation (COL1A1, COL1A2 and MMP13); the remainder were a nociceptor in sensory neurons (MrgA1), a structural gene of P lysozyme (Lzp-s), an immunoglobulin alpha heavy chain constant region gene (Igh-2), an osteocalcin-related protein precursor (Bglap-rs1), and a membrane-spanning 4 domain, subfamily A, member 3 (Ms4a3). Data demonstrated that elevated genes in the PKU-affected brain could be normalized by human PAH gene delivery. Although I could not precisely link transcript level changes and neurologic pathogenesis, this study provides a more comprehensive understanding of the PKU-affected brain at the molecular level, possibly resulting in better therapeutic approaches.
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