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박테리오파이지 DNA 중합효소의 전사 과정에 의해 DNA 절편의 염기 서열이 결정될 수 있다. 표준 전사 반응에 3'-디옥시뉴클리오타이드 사슬 종결자의 첨가는 400-염기 혹은 그 이상의 DNA 염기 의존성 TRNA 전사체 레더를 만들었다. T7 RNA 중합효소에 대해서, 많은 양의 RNA 전사체 레더 (특히 100-염기보다 짧은 레더)와 길고 짧은 크기의 균일한 형태의 RNA 전사체 레더를 만드는 조건을 ...

박테리오파이지 DNA 중합효소의 전사 과정에 의해 DNA 절편의 염기 서열이 결정될 수 있다. 표준 전사 반응에 3'-디옥시뉴클리오타이드 사슬 종결자의 첨가는 400-염기 혹은 그 이상의 DNA 염기 의존성 TRNA 전사체 레더를 만들었다. T7 RNA 중합효소에 대해서, 많은 양의 RNA 전사체 레더 (특히 100-염기보다 짧은 레더)와 길고 짧은 크기의 균일한 형태의 RNA 전사체 레더를 만드는 조건을 최적화 하였다. 최적의 3'dATP 농도는 전사체 RNA 크기에 따라 달랐다. 예를 들면, rNTRs 대 dNTPs의 농도비가 27-염기보다 짧은 RNA 레더에 대해서는 0.6 대 1 이 좋으며, 27-에서 37-염기는 1 대 1 이, 37에서 70까지는 1.5 대 1 이 70에서 80까지는 3 대 1 이, 80-염기보다 큰 경우는 6 대 1 이 최적이었다. 최적 마그네슈ㅂ 이온 농도는 RNA 크기뿐만 아니라, 3'-dATP 농도에 따라 달라졌다. Inorganic pyrophosphatase의 첨가는 염기 비의존성 RNA 전사체 양을 줄이고, 같은 염기서열이 연이어 나오는 부위의 양을 증가 시켰다. 중합효소의 양을 증가 시키면 디옥시-레더의 양이 증가하였다. RNA 레더의 양은 환형 주형에서 보다 짧은 선형 주형에서 1.5에서 2배 더 많이 만들어졌th?. T7과 SP6 RNA 중합효소, 전사 종결 효율이 증가된 3개의 SP6 돌연변이체와 N-terminal domain이 변형된 돌연변이체중, N-terminal domain이 변형된 T7rhk SP6 RNA 중합효소가 레더를 가장 많이 만들었다. 또한 \, N-terminal domain이 변형된 돌연변이체중, N-terminal domain이 변형된 T7과 SP6RNA 중합효소가 레더를 가장 많이 만들었다. 또한, N-terminal domain이 변형된 중합효소는 3'끝이 긴 주형에서 이상한 RNA 산물을 만드는 경향이 줄어들었다. 그러므로, RNA 전사체 레더는 DNA 염기서열결정을 위해서 젤전기영동과 mass spectrometry에 의해서 분석될 수 있다.

Abstract ▼ AI-Helper

It is demonstrated here that a DNA segment can be sequenced by transcription reactions of the bacteriophage RNA polymerases. Addition of 3'-deoxynucleoside 5'-triphosphate (3'-dNTP) chain terminators in the standard transcription reactions produced base-specific DNA-sequencing ladders of RNA transcr...

It is demonstrated here that a DNA segment can be sequenced by transcription reactions of the bacteriophage RNA polymerases. Addition of 3'-deoxynucleoside 5'-triphosphate (3'-dNTP) chain terminators in the standard transcription reactions produced base-specific DNA-sequencing ladders of RNA transcripts of 400 or more bases. The conditions for the T7 RNA polymerase transcription were optimized for higher yields of RNA ladders (especially those shorter than 100-mer), and for uniformity of the long and short RNA ladder bands. It was evident that optimum 3'-dATP concentration was different for different sizes of RNA. For example, the rNTPs/dNTPs ratio was optimal at 0.6:1 for RNA ladders shorter than 27-mer, at 1:1 for 27 to 37-mer, at 1.5:1 for 37 to 70-mer, at 3:1 for 70 to 80-mer and at 6:1 for longer than 80-mer. The optimum magnesium ion concentration appeared to depend not only on RNA size but also on the 3'-dATP concentration. Inclusion of inorganic pyrophosphatase appeared to reduce the non-specific band intensity, and enhance the band intensities of homo-oligonucleotide regions. The higher concentrations of enzymes were, the more deoxy-ladder bands were produced. The ladder RNAs were produced more from the short linear template by 1.5- to 2-fold than from the circular template. Not only the T7 and SP6 RNA polymerases but also three mutants and nick forms that had enhanced termination efficiency were tested. Among those, the nicked forms of both T7 and SP6 RNA polymerases produced the ladders most. Also, the nicked enzymes showed decreased tendency to produce aberrant transcription products from DNA templates having protruding 3'ends. Thus, the RNA transcript ladders could be analyzed for DNA sequencing by gel electrophoresis and mass spectrometry.

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