혈전용해제인 플라스민의 전구체인 플라스미노젠을 활성화시키는데 있어서 스트렙토키나제 상의 중요한 아미노산 잔기를 규명하기 위하여 무작위 돌연변이를 수행하였다. Skim milk와 인체 플라스미노젠을 사용한 overlay 실험에서 활성을 가지지 않는 312개의 돌연변이체를 선발하여 염기서열을 분석한 하였다. 이중 점돌연변이가 일어난 14개의 ...
혈전용해제인 플라스민의 전구체인 플라스미노젠을 활성화시키는데 있어서 스트렙토키나제 상의 중요한 아미노산 잔기를 규명하기 위하여 무작위 돌연변이를 수행하였다. Skim milk와 인체 플라스미노젠을 사용한 overlay 실험에서 활성을 가지지 않는 312개의 돌연변이체를 선발하여 염기서열을 분석한 하였다. 이중 점돌연변이가 일어난 14개의 변이체를 선발하고 흡광성 기질을 사용하여 펩타이드 가수분해능 측정실험을 하였다. 변이체들 중 6개 (D41C, S44K, S44P, R45P, H48T, D220G)의 돌연변이체는 야생형 스트렙토키나제와 비교했을 때 상당한 가수분해능을 보여주었고, 5개의 점돌연변이들이 스트렙토키나제의 Asp41-His48 부위에 집중되므로 이 부위가 기질로 작용하는 인체 플라스미노젠과의 결합에 중요한 기능을 한다. 스트렙토키나제의 $\alpha$ 도메인과 스타필로키나제 사이의 구조상, 아미노산 서열상의 유사성이 있으므로, 이들 부위의 역할도 유사할 것으로 생각되어 스트렙토키나제의 $\alpha$ 도메인을 스타필로키나제로 치환한 접합단백질을 제조하여 인체 플라스미노젠 활성화 능력을 조사하였다. 인체 플라스미노젠과 접합단백질을 같은 몰비로 반응시킨 동력학적 실험의 결과는 인체 플라스미노젠의 활성화를 위해 이들 접합단백질이 플라스민과 복합체를 형성한다는 것을 나타내었다. 피브리노젠 분해산물이 스타필로키나제와 스트렙토키나제의 $\beta$ 도메인이 연결된 접합단백질의 활성을 증진시키므로 이 접합단백질은 피브린특이성을 보인다. 이 결과들은 접합단백질들이 스타필로키나제와 같은 방식으로 인체 플라스미노젠을 활성화시킨다는 것을 나타내며 스트렙토키나제의 도메인들은 $\alpha$2-안티플라스민에 의한 플라스민 활성 저해에 영향을 끼치지 못함을 의미한다. 접합단백질이 스트렙토키나제와 같은 방식으로 인체 플라스미노젠을 활성화시키도록 하기 위하여 접합단백질의 아미노 말단을 스트레토키나제의 아미노 말단으로 치환하여 보았다. 스트렙토키나제의 $\beta$ 도메인만 연결된 접합단백질의 아미노 말단을 치환한 결과 플라스민과의 복합체 형성에는 영향이 없었지만, 스트렙토키나제의 $\beta$$\gamma$ 도메인이 연결된 접합단백질의 동력학적 실험의 결과는 흡광도 증가에 있어서 지연 현상이 짧아졌다. 이 결과는 스트렙토키나제가 플라스미노젠과의 복합체가 펩타이드 분해능을 가지기 위해서는 아미노 말단의 비친수성 아미노산 잔기와 $\gamma$ 도메인 모두를 필요로 한다는 것을 의미한다. 소의 플라스미노젠을 활성화 시키는 단백질은 인체 플라스민과 복합체를 형성하여 인체 플라스미노젠을 활성화 시켰다. 스트렙토키나제와 이 활성화 단백질사이에 서열상의 유사성이 있으므로 스트렙토키나제의 절편들의 플라스미노젠 활성화 능력을 조사하였다. 이들 절편 중 $\gamma$ 도메인이 완전히 제거된 크기를 가지는 절편이 소의 플라스미노젠을 활성화 시켰다. 이 결과는 스트렙토키나제의 $\gamma$ 도메인이 활성화에 필요한 플라스미노젠의 종류를 결정하고 인체 플라스미노젠 쪽으로 기질 특이성을 변환시킨다는 것을 의미한다.
혈전용해제인 플라스민의 전구체인 플라스미노젠을 활성화시키는데 있어서 스트렙토키나제 상의 중요한 아미노산 잔기를 규명하기 위하여 무작위 돌연변이를 수행하였다. Skim milk와 인체 플라스미노젠을 사용한 overlay 실험에서 활성을 가지지 않는 312개의 돌연변이체를 선발하여 염기서열을 분석한 하였다. 이중 점돌연변이가 일어난 14개의 변이체를 선발하고 흡광성 기질을 사용하여 펩타이드 가수분해능 측정실험을 하였다. 변이체들 중 6개 (D41C, S44K, S44P, R45P, H48T, D220G)의 돌연변이체는 야생형 스트렙토키나제와 비교했을 때 상당한 가수분해능을 보여주었고, 5개의 점돌연변이들이 스트렙토키나제의 Asp41-His48 부위에 집중되므로 이 부위가 기질로 작용하는 인체 플라스미노젠과의 결합에 중요한 기능을 한다. 스트렙토키나제의 $\alpha$ 도메인과 스타필로키나제 사이의 구조상, 아미노산 서열상의 유사성이 있으므로, 이들 부위의 역할도 유사할 것으로 생각되어 스트렙토키나제의 $\alpha$ 도메인을 스타필로키나제로 치환한 접합단백질을 제조하여 인체 플라스미노젠 활성화 능력을 조사하였다. 인체 플라스미노젠과 접합단백질을 같은 몰비로 반응시킨 동력학적 실험의 결과는 인체 플라스미노젠의 활성화를 위해 이들 접합단백질이 플라스민과 복합체를 형성한다는 것을 나타내었다. 피브리노젠 분해산물이 스타필로키나제와 스트렙토키나제의 $\beta$ 도메인이 연결된 접합단백질의 활성을 증진시키므로 이 접합단백질은 피브린 특이성을 보인다. 이 결과들은 접합단백질들이 스타필로키나제와 같은 방식으로 인체 플라스미노젠을 활성화시킨다는 것을 나타내며 스트렙토키나제의 도메인들은 $\alpha$2-안티플라스민에 의한 플라스민 활성 저해에 영향을 끼치지 못함을 의미한다. 접합단백질이 스트렙토키나제와 같은 방식으로 인체 플라스미노젠을 활성화시키도록 하기 위하여 접합단백질의 아미노 말단을 스트레토키나제의 아미노 말단으로 치환하여 보았다. 스트렙토키나제의 $\beta$ 도메인만 연결된 접합단백질의 아미노 말단을 치환한 결과 플라스민과의 복합체 형성에는 영향이 없었지만, 스트렙토키나제의 $\beta$$\gamma$ 도메인이 연결된 접합단백질의 동력학적 실험의 결과는 흡광도 증가에 있어서 지연 현상이 짧아졌다. 이 결과는 스트렙토키나제가 플라스미노젠과의 복합체가 펩타이드 분해능을 가지기 위해서는 아미노 말단의 비친수성 아미노산 잔기와 $\gamma$ 도메인 모두를 필요로 한다는 것을 의미한다. 소의 플라스미노젠을 활성화 시키는 단백질은 인체 플라스민과 복합체를 형성하여 인체 플라스미노젠을 활성화 시켰다. 스트렙토키나제와 이 활성화 단백질사이에 서열상의 유사성이 있으므로 스트렙토키나제의 절편들의 플라스미노젠 활성화 능력을 조사하였다. 이들 절편 중 $\gamma$ 도메인이 완전히 제거된 크기를 가지는 절편이 소의 플라스미노젠을 활성화 시켰다. 이 결과는 스트렙토키나제의 $\gamma$ 도메인이 활성화에 필요한 플라스미노젠의 종류를 결정하고 인체 플라스미노젠 쪽으로 기질 특이성을 변환시킨다는 것을 의미한다.
Random mutagenesis of streptokinase was carried out to determine critical amino acid residues in plasminogen activation. Fourteen streptokinase mutants without plasminogen activation activity on skim milk-plasminogen overlay plate were selected and sequenced. Specific activities of the selected stre...
Random mutagenesis of streptokinase was carried out to determine critical amino acid residues in plasminogen activation. Fourteen streptokinase mutants without plasminogen activation activity on skim milk-plasminogen overlay plate were selected and sequenced. Specific activities of the selected streptokinase mutants were determined by chromogenic assay. Six mutants (D41C, S44K, S44P, R45P, H48T and D220G) showed substantial amidolytic activities as compared with that of wild type. Moreover, five point mutations in Asp41-His48 region of a streptokinase plays an important role in binding to a substrate plasminogen. Because of the structural and sequence similarity of SK$\alpha$ domain to those of staphylokinase, it is thought that they play a similar role. The chimeric proteins substituted SK$\alpha$ domain with staphylokinase were examined for their activity of plasminogen activation. The kinetics of equimolar mixture of a plasminogen and the fusion proteins showed that these fusion proteins bound to human plasmin for plasminogen activation. Fibrinogen degradation product enhanced the activity of staphylokinase-SK$\beta$ fused protein suggesting that fibrin specificity of the fusion protein. These results suggest that the fusion proteins activate a human plasminogen in staphylokinase mode and that the domains of streptokinase did not influence the inhibition of human plasmin by $\alpha$2-antiplasmin. The N-terminus of staphylokinase-streptokinase fusion protein was substituted by the N-terminus of streptokinase. The serial substitution showed that the non-hydrophilic residues at the N-terminus of the fusion proteins without SK$\gamma$ domain did not affect the formation of active plasmin-activator complex. However, the fusion mutants with $\gamma$ domain shortened the lag times in kinetic data. These results propose that streptokinase requires the N-terminal non-hydrophilic residues and $\gamma$ domain for formation of the active streptokinase-plasminogen complex. Recombinant bovine plasminogen activator also activated human plasminogen by staphylokinase-like activation mode. Because the activator has homology with streptokinase, the bovine plasminogen activation activities of streptokinase fragments were examined. Streptokinase fragment without $\gamma$ domain among them activated bovine plasminogen. These data suggest that the $\gamma$ domain of streptokinase determines plasminogen species necessary for activation, and converses ability of substrate recognition to human species.
Random mutagenesis of streptokinase was carried out to determine critical amino acid residues in plasminogen activation. Fourteen streptokinase mutants without plasminogen activation activity on skim milk-plasminogen overlay plate were selected and sequenced. Specific activities of the selected streptokinase mutants were determined by chromogenic assay. Six mutants (D41C, S44K, S44P, R45P, H48T and D220G) showed substantial amidolytic activities as compared with that of wild type. Moreover, five point mutations in Asp41-His48 region of a streptokinase plays an important role in binding to a substrate plasminogen. Because of the structural and sequence similarity of SK$\alpha$ domain to those of staphylokinase, it is thought that they play a similar role. The chimeric proteins substituted SK$\alpha$ domain with staphylokinase were examined for their activity of plasminogen activation. The kinetics of equimolar mixture of a plasminogen and the fusion proteins showed that these fusion proteins bound to human plasmin for plasminogen activation. Fibrinogen degradation product enhanced the activity of staphylokinase-SK$\beta$ fused protein suggesting that fibrin specificity of the fusion protein. These results suggest that the fusion proteins activate a human plasminogen in staphylokinase mode and that the domains of streptokinase did not influence the inhibition of human plasmin by $\alpha$2-antiplasmin. The N-terminus of staphylokinase-streptokinase fusion protein was substituted by the N-terminus of streptokinase. The serial substitution showed that the non-hydrophilic residues at the N-terminus of the fusion proteins without SK$\gamma$ domain did not affect the formation of active plasmin-activator complex. However, the fusion mutants with $\gamma$ domain shortened the lag times in kinetic data. These results propose that streptokinase requires the N-terminal non-hydrophilic residues and $\gamma$ domain for formation of the active streptokinase-plasminogen complex. Recombinant bovine plasminogen activator also activated human plasminogen by staphylokinase-like activation mode. Because the activator has homology with streptokinase, the bovine plasminogen activation activities of streptokinase fragments were examined. Streptokinase fragment without $\gamma$ domain among them activated bovine plasminogen. These data suggest that the $\gamma$ domain of streptokinase determines plasminogen species necessary for activation, and converses ability of substrate recognition to human species.
주제어
#streptokinase mechanism plasminogen activation evolution 스트렙토키나제 작용기작 플라스미노젠 활성화 진화
학위논문 정보
저자
Kim, Dong-Min
학위수여기관
한국과학기술원
학위구분
국내박사
학과
생물과학과
지도교수
변시명,Byun, Si Myung
발행연도
2002
총페이지
viii, 91 p.
키워드
streptokinase mechanism plasminogen activation evolution 스트렙토키나제 작용기작 플라스미노젠 활성화 진화
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