[학위논문]유해성 적조를 일으키는 미세조류에 대한 Micrococcus luteus SY-13의 살조효과에 대한 연구 Algicidal Effects of Micrococcus luteus SY-13 against Harmful Algal Bloom Species원문보기
본 연구에서는 적조생물Cochlodinium polykrikoides가 일으키는 적조현상을 생물학적으로 제어 하기 위해서, 우수한 살조 미생물을 해양으로부터 분리하였다. 총 7종의 살조세균이 분리되었으며 형태학적, 배양학적, 생리학적 특성 및 16S rDNA sequence등 분류학적 특성을 바탕으로 동정을 실시한 결과 분리된 7종의 살조세균은 Bacillus, Dietzia, Janibacter 및 Micrococcus 속에 속하는 것으로 나타났다. 7종의 살조세균 중 SY-13균주가 가장 뛰어난 살조활성을 나타냈으므로 이후의 실험을 위한 균주로 선정하였으며, 본 균주는 Micrococcus luteus 와 높은 ...
본 연구에서는 적조생물Cochlodinium polykrikoides가 일으키는 적조현상을 생물학적으로 제어 하기 위해서, 우수한 살조 미생물을 해양으로부터 분리하였다. 총 7종의 살조세균이 분리되었으며 형태학적, 배양학적, 생리학적 특성 및 16S rDNA sequence등 분류학적 특성을 바탕으로 동정을 실시한 결과 분리된 7종의 살조세균은 Bacillus, Dietzia, Janibacter 및 Micrococcus 속에 속하는 것으로 나타났다. 7종의 살조세균 중 SY-13균주가 가장 뛰어난 살조활성을 나타냈으므로 이후의 실험을 위한 균주로 선정하였으며, 본 균주는 Micrococcus luteus 와 높은 상동성을 나타내어 M. luteus SY-13으로 명명하였다. 그리고 이 균주는 균체의 생장과 함께 살조물질을 배양액으로 분비하는 살조물질 분비형으로 나타났다. M. luteus SY-13의 살조물질 생산 최적 조건은 25℃, pH 8.0, NaCl 농도는 3.0%인 것으로 나타났다. 또한 M. luteus SY-13가 생산하는 살조물질을 포함하는 배양 상등액은 C. polykrikoides이외의 다른 적조 생물들에도 넓은 살조능을 나타내었으며 특히, 침편모조류인 Chattonella sp. 와 와편모조류인C. polykrikoides에 대해 아주 뛰어난 살조활성을 나타냈다. 하지만, 세포 크기가 큰 적조 생물들에 비해 Heterosigma akashiwo 와 Prorocentrum minimum 같은 세포 크기가 작은 미세조류에 대해서는 살조활성이 낮은 것으로 관찰되었다. 또한, 이 균주는 규조류, 녹조류, 남조류 및 치자어에 먹이 생물로 사용되는 미세조류에 대해서는 Isocrysis galbana 를 제외하고는 어떠한 저해능도 나타내지 않았다. M. luteus SY-13의 배양 상등액에 대한 항균성과 살조 안정성을 알아본 결과 본 살조물질은 실험한 모든 미생물에 대해 항균성을 나타내지 않았으며, 100℃에서 한시간 동안의 가열에도 살조 활성을 잃지 않는 것으로 나타났지만 121℃ 이상의 가열이나 강 알칼리 조건에서는 그 살조 활성이 급격히 저하 하는 것을 관찰 할 수 있었다. M. luteus SY-13이 생산하는 살조물질의 특성을 더 자세히 알아보기 위하여 살조물질의 정제와 구조 분석을 실시하였다. 유기 용매 추출과 DOS-column 크로마토그래피 그리고 HPLC를 통해 정제를 실시 한 후, GC-Mass 와 NMR분석을 통하여 구조 분석을 실시하였다. 그 결과, M. luteus SY-13가 생산하는 살조물질은 β-carboline으로 동정되었다. 본 물질을 C. polykrikoides에 처리했을 경우 6시간만에 50%의 치사율을 나타내는데 필요한 LC50 값은 0.66 µg/ml으로 나타났다. β-carboline은 C. polykrikoides 이외에도 다른 유해성 적조를 일으키는 와편모종이나 침편모종들에도 넓은 범위의 뛰어난 살조 활성을 나타내었으며 유해한 종으로 알려진 Alexandrium catennella, P. micans 및 H. akashiwo에 대해서도 살조 활성을 나타내었다. β-carboline의 항균성 및 항진균성을 살펴 본 결과 그람 음성균인 Marinibacillus marinus 와 그람 양성균인 Cytophaga marinoflava, Cytophaga uliginosa 및 병원성 세균으로 알려진 Vibrio parahemolyticus 에 대해서도 50 µg/disc 의 농도에서 항균성을 나타 내는 것을 알수 있었다. 본 연구에서 분리된 M. luteus SY-13를 환경에 적용 시키기 위한 기초 자료를 확립하기 위해서 M. luteus SY-13를 직접 해양 환경과 유사한 적조 배양액에 접종한 후 M. luteus SY-13의 생존여부와 살조능을 살펴 보았다. 살조세균 첨가 실험에서 C. polykrikoides의 초기 농도가 높으면 높을수록 그리고 접종하는 살조세균의 농도가 높을수록 살조능은 더 빠르고 효율적인 것으로 관찰되었다. C.polykrikoides 과 관련된 세균의 군집의 변동을 PCR-DGGE를 통하여 조사하가 위해 M. luteus SY-13을 C. polykrikoides 배양액에 직접 첨가하자 시간에 따라 세균군집의 변동이 관찰되었다. 배양 시간에 따라 우점종을 나타내는 band의 수와 그 강도가 변하였지만, 몇몇 band는 배양 초기부터 실험이 끝나는 날까지도 우점종으로 관찰 되었다. DGGE 결과로부터 계통분석을 하기위해 육안으로 선명하게 관찰되는 총 22개의 band들은 자른 후 sequencing을 실시 하였다. 그 결과 우점종으로 나타났던 band들은 각각 Devosia sp., Alteromonas tagae, uncultured bacterium clone GN01-8.128 그리고 uncultured alpha Proteobacterium과 가장 유사도가 높은 것으로 나타났다. 본 연구에서는 살조세균 첨가이후 나타나는 세균군집 변동에 대한 정확한 기작은 조사되지 않았기 때문에 환경 적용을 고려한다면 더 많은 연구가 필요 할 것으로 사료된다. 본 연구에서 얻어진 이러한 결과들로부터 M. luteus SY-13 은 유해성 적조를 제어하기 위해서 황토나 점토 살포법 및 화학살조제를 대신할 수 있는 경쟁력있고 효과적인 대응책이 될수 있을 것으로 사료된다.
본 연구에서는 적조생물Cochlodinium polykrikoides가 일으키는 적조현상을 생물학적으로 제어 하기 위해서, 우수한 살조 미생물을 해양으로부터 분리하였다. 총 7종의 살조세균이 분리되었으며 형태학적, 배양학적, 생리학적 특성 및 16S rDNA sequence등 분류학적 특성을 바탕으로 동정을 실시한 결과 분리된 7종의 살조세균은 Bacillus, Dietzia, Janibacter 및 Micrococcus 속에 속하는 것으로 나타났다. 7종의 살조세균 중 SY-13균주가 가장 뛰어난 살조활성을 나타냈으므로 이후의 실험을 위한 균주로 선정하였으며, 본 균주는 Micrococcus luteus 와 높은 상동성을 나타내어 M. luteus SY-13으로 명명하였다. 그리고 이 균주는 균체의 생장과 함께 살조물질을 배양액으로 분비하는 살조물질 분비형으로 나타났다. M. luteus SY-13의 살조물질 생산 최적 조건은 25℃, pH 8.0, NaCl 농도는 3.0%인 것으로 나타났다. 또한 M. luteus SY-13가 생산하는 살조물질을 포함하는 배양 상등액은 C. polykrikoides이외의 다른 적조 생물들에도 넓은 살조능을 나타내었으며 특히, 침편모조류인 Chattonella sp. 와 와편모조류인C. polykrikoides에 대해 아주 뛰어난 살조활성을 나타냈다. 하지만, 세포 크기가 큰 적조 생물들에 비해 Heterosigma akashiwo 와 Prorocentrum minimum 같은 세포 크기가 작은 미세조류에 대해서는 살조활성이 낮은 것으로 관찰되었다. 또한, 이 균주는 규조류, 녹조류, 남조류 및 치자어에 먹이 생물로 사용되는 미세조류에 대해서는 Isocrysis galbana 를 제외하고는 어떠한 저해능도 나타내지 않았다. M. luteus SY-13의 배양 상등액에 대한 항균성과 살조 안정성을 알아본 결과 본 살조물질은 실험한 모든 미생물에 대해 항균성을 나타내지 않았으며, 100℃에서 한시간 동안의 가열에도 살조 활성을 잃지 않는 것으로 나타났지만 121℃ 이상의 가열이나 강 알칼리 조건에서는 그 살조 활성이 급격히 저하 하는 것을 관찰 할 수 있었다. M. luteus SY-13이 생산하는 살조물질의 특성을 더 자세히 알아보기 위하여 살조물질의 정제와 구조 분석을 실시하였다. 유기 용매 추출과 DOS-column 크로마토그래피 그리고 HPLC를 통해 정제를 실시 한 후, GC-Mass 와 NMR분석을 통하여 구조 분석을 실시하였다. 그 결과, M. luteus SY-13가 생산하는 살조물질은 β-carboline으로 동정되었다. 본 물질을 C. polykrikoides에 처리했을 경우 6시간만에 50%의 치사율을 나타내는데 필요한 LC50 값은 0.66 µg/ml으로 나타났다. β-carboline은 C. polykrikoides 이외에도 다른 유해성 적조를 일으키는 와편모종이나 침편모종들에도 넓은 범위의 뛰어난 살조 활성을 나타내었으며 유해한 종으로 알려진 Alexandrium catennella, P. micans 및 H. akashiwo에 대해서도 살조 활성을 나타내었다. β-carboline의 항균성 및 항진균성을 살펴 본 결과 그람 음성균인 Marinibacillus marinus 와 그람 양성균인 Cytophaga marinoflava, Cytophaga uliginosa 및 병원성 세균으로 알려진 Vibrio parahemolyticus 에 대해서도 50 µg/disc 의 농도에서 항균성을 나타 내는 것을 알수 있었다. 본 연구에서 분리된 M. luteus SY-13를 환경에 적용 시키기 위한 기초 자료를 확립하기 위해서 M. luteus SY-13를 직접 해양 환경과 유사한 적조 배양액에 접종한 후 M. luteus SY-13의 생존여부와 살조능을 살펴 보았다. 살조세균 첨가 실험에서 C. polykrikoides의 초기 농도가 높으면 높을수록 그리고 접종하는 살조세균의 농도가 높을수록 살조능은 더 빠르고 효율적인 것으로 관찰되었다. C.polykrikoides 과 관련된 세균의 군집의 변동을 PCR-DGGE를 통하여 조사하가 위해 M. luteus SY-13을 C. polykrikoides 배양액에 직접 첨가하자 시간에 따라 세균군집의 변동이 관찰되었다. 배양 시간에 따라 우점종을 나타내는 band의 수와 그 강도가 변하였지만, 몇몇 band는 배양 초기부터 실험이 끝나는 날까지도 우점종으로 관찰 되었다. DGGE 결과로부터 계통분석을 하기위해 육안으로 선명하게 관찰되는 총 22개의 band들은 자른 후 sequencing을 실시 하였다. 그 결과 우점종으로 나타났던 band들은 각각 Devosia sp., Alteromonas tagae, uncultured bacterium clone GN01-8.128 그리고 uncultured alpha Proteobacterium과 가장 유사도가 높은 것으로 나타났다. 본 연구에서는 살조세균 첨가이후 나타나는 세균군집 변동에 대한 정확한 기작은 조사되지 않았기 때문에 환경 적용을 고려한다면 더 많은 연구가 필요 할 것으로 사료된다. 본 연구에서 얻어진 이러한 결과들로부터 M. luteus SY-13 은 유해성 적조를 제어하기 위해서 황토나 점토 살포법 및 화학살조제를 대신할 수 있는 경쟁력있고 효과적인 대응책이 될수 있을 것으로 사료된다.
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