칼슘은 동.식물을 포함한 eukaryotic system에서 second messenger로서 매우 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 포유 동물의 경우, 수정과 증식, 근육의 발달과 수축, 신경돌기의 성장과 같은 세포반응을 조절하며 (Berridge et al., 1998; Berridge et al., 2000; Crabtree, 2001) 식물의 경우, 꽃가루 관의 신장, 뿌리털의 생장, 그리고 공변세포의 팽압 조절 등 다양한 발달과정에서 역할을 수행한다 (Holdaway-Clarke et al., 1997; Wymer et al., 1997; Blatt, 2000). 또한, 식물은 빛, ...
칼슘은 동.식물을 포함한 eukaryotic system에서 second messenger로서 매우 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 포유 동물의 경우, 수정과 증식, 근육의 발달과 수축, 신경돌기의 성장과 같은 세포반응을 조절하며 (Berridge et al., 1998; Berridge et al., 2000; Crabtree, 2001) 식물의 경우, 꽃가루 관의 신장, 뿌리털의 생장, 그리고 공변세포의 팽압 조절 등 다양한 발달과정에서 역할을 수행한다 (Holdaway-Clarke et al., 1997; Wymer et al., 1997; Blatt, 2000). 또한, 식물은 빛, 식물호르몬, 병원균 침입, 그리고 각종 abiotic stress반응에도 Ca^(2+)을 second messenger로서 사용한다 (Ehrhardt et al., 1996; Baum et al., 1999; Sanders et al., 1999; Grant et al., 2000; Kiegle et al., 2000; MacRobbie, 2000; Evans et al., 2001). 단백질도 아닌 단순한 Ca^(2+)이온이 다양한 신호전달체계를 조절하면서 특이적인 반응을 일으킬 수 있는 특징으로는 세가지가 있다. 먼저, Ca^(2+)신호자체의 복잡성을 들 수 있다. Ca^(2+)신호는 시.공간적인 요소로 구성되어 있으며 시간적인 요소로서 단순히 농도의 변화뿐만 아니라 변화의 빈도수와 진폭 등을 포함하며 공간적인 요소로서 Ca^(2+)신호는 세포 내 위치와 세포의 종류에 따라 특이적인 Ca^(2+)신호를 유도할 수 있다 (Dolmetsch et al., 1997; Dolmetsch et al., 1998; Evans et al., 2001; Rudd and Franklin-Tong, 2001). 고등식물에는 Ca^(2+)의 변화를 인지하여 다양한 세포 내 반응을 일으키는 칼슘결합단백질이 여러 그룹존재하며 대표적인 Ca^(2+) sensor로는 calmodulin (CaM), Ca^(2+)-dependent protein kinase (CDPK), 그리고 calcineurin B-like (CBL) protein 등이 있다. 또한, 각각의 Ca^(2+) sensor들은 서로 다른 목표단백질과 상호작용을 함으로써 세포내의 서로 다른 신호전달과정을 조절한다. CaM은 효소의 활성을 가지고 있지 않아 NAD kinase, glutamate decarboxylase, 그리고 Ca^(2+)-ATPase와 같은 kinase를 목표단백질로 가지며 (Zielinski, 1998; Snedden and Fromm, 2001; Luan et al., 2002; Reddy et al., 2002) CDPK는 sucrose phosphate synthase, nitrate reductase등의 기질을 인산화 시킨다 (Douglas et al., 1998; Hwang et al., 2000; Rudd and Franklin-Tong, 2001). 세 번째로, CBL은 ser/thr protein kinase인 CIPK family와 상호작용을 한다 (Shi et al., 1999; Halfter et al., 2000; Kim et al., 2000; Albrecht et al., 2001). CBL family를 통한 Ca^(2+)신호전달을 간단히 요약해보면, cold, drought, salt, 그리고 ABA와 같은 다양한 외부자극에 의해 발생된 Ca^(2+)신호의 변화는 칼슘결합단백질인 CBL에 의해 인식되어 이들과 상호작용하는 CIPK로 신호를 전달하고, 궁극적으로 핵으로 신호를 전달하여 각각의 스트레스 관련 유전자들의 발현을 조절함으로써 특이적인 세포 내 반응을 유도한다고 생각할 수 있다. 많은 CBL-CIPK 신호전달과정 중, CBL1, CBL9과 CIPK1은 세포막에서 complex를 이룬다고 알려져 있다. 그렇다면 CBL1/CBL9-CIPK1이 세포막에서 핵으로 신호를 어떻게 전달하는지 알아보기 위하여 CIPK1을 bait로 yeast screening을 수행하였고 그 결과, CIPK1의 interacting partner로서 ECT1을 선별하였다. ECT1은 C-terminal부위에 진화적으로 보존된 domain을 가지고 있으며 이 domain은 ECT1이 핵으로 targeting되는데 중요한 역할을 하고 있다 (Ok et al., 2005). 이전 논문에서 yeast two-hybrid assay와 pull-down assay를 통해 확인된 ECT1과 CIPK1이 plant cells에서 실제로 상호작용하는지 알아보기 위하여 BiFC를 수행하였고 그 결과 ECT1과 CIPK1이 핵이 아닌 세포막부분에서 상호작용을 한다는 것을 알 수 있었다. 또한, BiFC를 통하여 이미 알려져 있는 CBL1, CBL9과 CIPK1이 세포막에서 상호작용함을 확인하였다. ECT1과 CIPK1이 세포막에서 상호작용을 한다면 ECT1과 CIPK1의 상호작용에 CBL1또는 CBL9이 어떠한 영향을 끼치는지 알아보기 위하여 yeast three-hybrid assay와 pull-down assay를 수행하였고 그 결과, CBL1과 CBL9이 ECT1과 CIPK1의 상호작용을 방해한다는 것을 알 수 있었다. 그래서 지금까지 결과로 보아, 외부로부터 자극이 왔을 때 발생한 다양한 Ca^(2+)신호는 Ca^(2+) sensor인 CBL1에 의해 인식되어 CIPK1으로 신호를 전달하게 되고 CBL1과 CIPK1이 상호작용함으로써, CIPK1과 세포막에서 상호작용을 하고 있던 ECT1이 떨어져 나와 핵으로 이동하여 기능을 할 것이라 예상된다. CBL-CIPK 관련경로는 cold, drought, salt, 그리고 ABA와 같은 다양한 abiotic stress에 의해 조절된다고 알려져 있기 때문에 ECT1 또한 abiotic stress에 관여할 것이라 예상되어 실험을 수행하였지만 예상과는 다르게 ECT1의 경우, wild-type (Col-0)와 비교하여 abiotic stress자극에 대한 표현형의 차이를 보이지 않았다. 그래서, 그렇다면 ECT1이 어떠한 자극에 반응하는지 알아보기 위하여 microarray를 수행하였고 그 결과 biotic stress와 관련된 유전자들의 발현이 ect1 mutant에서 발현이 감소되어 있음을 확인하였다. Pseudomonas DC3000 avrRpm1을 처리해 본 결과 RPM1에 dependent하게 나타나는 HR반응이 ect1 mutant에서는 나타나지 않는 것을 볼 수 있었고 electrolyte leakage실험을 통해 ect1 mutant에서 HR이 일어나지 않았음을 예상할 수 있었다. 또한, ect1 mutant는 A. brassicicola에 hypersensitivity를 보였으며 이것은 tryphane blue staining을 이용한 균사체 형성비교를 통해 확인하였다. 그래서 ECT1이 A. brassicicola infection에 대한 defense 반응에 관여할 것이라 예상되어 ect1 mutant에서 A. brassicicola infection에 의한 marker gene들의 발현을 확인해 본 결과, PR gene들과 GLIP1 gene의 발현이 wild-type (Col-0)에 비해 감소되어 있는 것을 확인하였고 그 중에서 PR3와 PR4가 가장 많은 차이를 보이는 것으로 보아 ECT1이 JA signaling에 관여할 것이라 예상하였다. 그래서 JA signaling의 대표적인 marker gene인 PDF1.2의 발현을 확인해본 결과, A. brassicicola infection에 의한 PDF1.2의 induction이 ect1 mutant에서는 되지 않는 것을 볼 수 있었다. 그러나 MJ를 처리한 sample의 PDF1.2발현을 확인해본 결과, 예상과는 다르게 ect1 mutant가 wild-type과 비슷하거나 오히려 더 sensitive하게 증가된 것을 확인 할 수 있었다. 이 결과를 통해 ect1 mutant는 JA에 의한 signaling이 아닌 JA의 합성 또는 양에 문제가 있을 것이라 예상하게 되었다. 그래서 JA의 생합성 과정에 관여하는 세 enzyme의 발현을 확인해본 결과 JA 생합성의 regulatory step이라고 생각되는 LOX 유전자의 induction이 ect1 mutant에서 억제되어있는 것을 확인하였다. 그래서 ect1 mutant는 JA의 합성을 제대로 하지 못해서 pathogen defense반응을 일으키지 못할 것이라 예상된다. 호르몬에 의한 ECT1의 발현을 비교해 본 결과, MJ와 SA에 의해서만 ECT1의 발현이 약하게 induction되는 것을 확인하였다. 지금까지의 결과를 종합해보면, 외부로부터 bacteria나 fungi와 같은 biotic stress에 의해 변화된 세포 내의 칼슘신호는 Ca^(2+) sensor인 CBL1에 의해 인지되어 목표단백질인 CIPK1으로 신호를 전달하게 되고, 이때 CBL1과 CIPK1이 상호작용함으로써 CIPK1과 세포막에서 상호작용하고 있던 ECT1은 세포막에서 떨어져 나와 핵으로 이동하게 되고, 핵에서 JA합성과 관련하여 pathogen defense반응에 관여 할 것이라 예상된다.
칼슘은 동.식물을 포함한 eukaryotic system에서 second messenger로서 매우 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 포유 동물의 경우, 수정과 증식, 근육의 발달과 수축, 신경돌기의 성장과 같은 세포반응을 조절하며 (Berridge et al., 1998; Berridge et al., 2000; Crabtree, 2001) 식물의 경우, 꽃가루 관의 신장, 뿌리털의 생장, 그리고 공변세포의 팽압 조절 등 다양한 발달과정에서 역할을 수행한다 (Holdaway-Clarke et al., 1997; Wymer et al., 1997; Blatt, 2000). 또한, 식물은 빛, 식물호르몬, 병원균 침입, 그리고 각종 abiotic stress반응에도 Ca^(2+)을 second messenger로서 사용한다 (Ehrhardt et al., 1996; Baum et al., 1999; Sanders et al., 1999; Grant et al., 2000; Kiegle et al., 2000; MacRobbie, 2000; Evans et al., 2001). 단백질도 아닌 단순한 Ca^(2+)이온이 다양한 신호전달체계를 조절하면서 특이적인 반응을 일으킬 수 있는 특징으로는 세가지가 있다. 먼저, Ca^(2+)신호자체의 복잡성을 들 수 있다. Ca^(2+)신호는 시.공간적인 요소로 구성되어 있으며 시간적인 요소로서 단순히 농도의 변화뿐만 아니라 변화의 빈도수와 진폭 등을 포함하며 공간적인 요소로서 Ca^(2+)신호는 세포 내 위치와 세포의 종류에 따라 특이적인 Ca^(2+)신호를 유도할 수 있다 (Dolmetsch et al., 1997; Dolmetsch et al., 1998; Evans et al., 2001; Rudd and Franklin-Tong, 2001). 고등식물에는 Ca^(2+)의 변화를 인지하여 다양한 세포 내 반응을 일으키는 칼슘결합단백질이 여러 그룹존재하며 대표적인 Ca^(2+) sensor로는 calmodulin (CaM), Ca^(2+)-dependent protein kinase (CDPK), 그리고 calcineurin B-like (CBL) protein 등이 있다. 또한, 각각의 Ca^(2+) sensor들은 서로 다른 목표단백질과 상호작용을 함으로써 세포내의 서로 다른 신호전달과정을 조절한다. CaM은 효소의 활성을 가지고 있지 않아 NAD kinase, glutamate decarboxylase, 그리고 Ca^(2+)-ATPase와 같은 kinase를 목표단백질로 가지며 (Zielinski, 1998; Snedden and Fromm, 2001; Luan et al., 2002; Reddy et al., 2002) CDPK는 sucrose phosphate synthase, nitrate reductase등의 기질을 인산화 시킨다 (Douglas et al., 1998; Hwang et al., 2000; Rudd and Franklin-Tong, 2001). 세 번째로, CBL은 ser/thr protein kinase인 CIPK family와 상호작용을 한다 (Shi et al., 1999; Halfter et al., 2000; Kim et al., 2000; Albrecht et al., 2001). CBL family를 통한 Ca^(2+)신호전달을 간단히 요약해보면, cold, drought, salt, 그리고 ABA와 같은 다양한 외부자극에 의해 발생된 Ca^(2+)신호의 변화는 칼슘결합단백질인 CBL에 의해 인식되어 이들과 상호작용하는 CIPK로 신호를 전달하고, 궁극적으로 핵으로 신호를 전달하여 각각의 스트레스 관련 유전자들의 발현을 조절함으로써 특이적인 세포 내 반응을 유도한다고 생각할 수 있다. 많은 CBL-CIPK 신호전달과정 중, CBL1, CBL9과 CIPK1은 세포막에서 complex를 이룬다고 알려져 있다. 그렇다면 CBL1/CBL9-CIPK1이 세포막에서 핵으로 신호를 어떻게 전달하는지 알아보기 위하여 CIPK1을 bait로 yeast screening을 수행하였고 그 결과, CIPK1의 interacting partner로서 ECT1을 선별하였다. ECT1은 C-terminal부위에 진화적으로 보존된 domain을 가지고 있으며 이 domain은 ECT1이 핵으로 targeting되는데 중요한 역할을 하고 있다 (Ok et al., 2005). 이전 논문에서 yeast two-hybrid assay와 pull-down assay를 통해 확인된 ECT1과 CIPK1이 plant cells에서 실제로 상호작용하는지 알아보기 위하여 BiFC를 수행하였고 그 결과 ECT1과 CIPK1이 핵이 아닌 세포막부분에서 상호작용을 한다는 것을 알 수 있었다. 또한, BiFC를 통하여 이미 알려져 있는 CBL1, CBL9과 CIPK1이 세포막에서 상호작용함을 확인하였다. ECT1과 CIPK1이 세포막에서 상호작용을 한다면 ECT1과 CIPK1의 상호작용에 CBL1또는 CBL9이 어떠한 영향을 끼치는지 알아보기 위하여 yeast three-hybrid assay와 pull-down assay를 수행하였고 그 결과, CBL1과 CBL9이 ECT1과 CIPK1의 상호작용을 방해한다는 것을 알 수 있었다. 그래서 지금까지 결과로 보아, 외부로부터 자극이 왔을 때 발생한 다양한 Ca^(2+)신호는 Ca^(2+) sensor인 CBL1에 의해 인식되어 CIPK1으로 신호를 전달하게 되고 CBL1과 CIPK1이 상호작용함으로써, CIPK1과 세포막에서 상호작용을 하고 있던 ECT1이 떨어져 나와 핵으로 이동하여 기능을 할 것이라 예상된다. CBL-CIPK 관련경로는 cold, drought, salt, 그리고 ABA와 같은 다양한 abiotic stress에 의해 조절된다고 알려져 있기 때문에 ECT1 또한 abiotic stress에 관여할 것이라 예상되어 실험을 수행하였지만 예상과는 다르게 ECT1의 경우, wild-type (Col-0)와 비교하여 abiotic stress자극에 대한 표현형의 차이를 보이지 않았다. 그래서, 그렇다면 ECT1이 어떠한 자극에 반응하는지 알아보기 위하여 microarray를 수행하였고 그 결과 biotic stress와 관련된 유전자들의 발현이 ect1 mutant에서 발현이 감소되어 있음을 확인하였다. Pseudomonas DC3000 avrRpm1을 처리해 본 결과 RPM1에 dependent하게 나타나는 HR반응이 ect1 mutant에서는 나타나지 않는 것을 볼 수 있었고 electrolyte leakage실험을 통해 ect1 mutant에서 HR이 일어나지 않았음을 예상할 수 있었다. 또한, ect1 mutant는 A. brassicicola에 hypersensitivity를 보였으며 이것은 tryphane blue staining을 이용한 균사체 형성비교를 통해 확인하였다. 그래서 ECT1이 A. brassicicola infection에 대한 defense 반응에 관여할 것이라 예상되어 ect1 mutant에서 A. brassicicola infection에 의한 marker gene들의 발현을 확인해 본 결과, PR gene들과 GLIP1 gene의 발현이 wild-type (Col-0)에 비해 감소되어 있는 것을 확인하였고 그 중에서 PR3와 PR4가 가장 많은 차이를 보이는 것으로 보아 ECT1이 JA signaling에 관여할 것이라 예상하였다. 그래서 JA signaling의 대표적인 marker gene인 PDF1.2의 발현을 확인해본 결과, A. brassicicola infection에 의한 PDF1.2의 induction이 ect1 mutant에서는 되지 않는 것을 볼 수 있었다. 그러나 MJ를 처리한 sample의 PDF1.2발현을 확인해본 결과, 예상과는 다르게 ect1 mutant가 wild-type과 비슷하거나 오히려 더 sensitive하게 증가된 것을 확인 할 수 있었다. 이 결과를 통해 ect1 mutant는 JA에 의한 signaling이 아닌 JA의 합성 또는 양에 문제가 있을 것이라 예상하게 되었다. 그래서 JA의 생합성 과정에 관여하는 세 enzyme의 발현을 확인해본 결과 JA 생합성의 regulatory step이라고 생각되는 LOX 유전자의 induction이 ect1 mutant에서 억제되어있는 것을 확인하였다. 그래서 ect1 mutant는 JA의 합성을 제대로 하지 못해서 pathogen defense반응을 일으키지 못할 것이라 예상된다. 호르몬에 의한 ECT1의 발현을 비교해 본 결과, MJ와 SA에 의해서만 ECT1의 발현이 약하게 induction되는 것을 확인하였다. 지금까지의 결과를 종합해보면, 외부로부터 bacteria나 fungi와 같은 biotic stress에 의해 변화된 세포 내의 칼슘신호는 Ca^(2+) sensor인 CBL1에 의해 인지되어 목표단백질인 CIPK1으로 신호를 전달하게 되고, 이때 CBL1과 CIPK1이 상호작용함으로써 CIPK1과 세포막에서 상호작용하고 있던 ECT1은 세포막에서 떨어져 나와 핵으로 이동하게 되고, 핵에서 JA합성과 관련하여 pathogen defense반응에 관여 할 것이라 예상된다.
CIPK1 interacts with a couple of calcineurin B-like (CBL) calcium sensors such as CBL1 and CBL9. Therefore it is believed that CIPK1 is also involved in a variety of stress signal transduction pathways which use Ca^(2+) as a second messenger. The ECT1 (evolutionarily conserved C-terminal region) gen...
CIPK1 interacts with a couple of calcineurin B-like (CBL) calcium sensors such as CBL1 and CBL9. Therefore it is believed that CIPK1 is also involved in a variety of stress signal transduction pathways which use Ca^(2+) as a second messenger. The ECT1 (evolutionarily conserved C-terminal region) gene in known as CIPK1 interacting partner that can be targeted into the nucleus. BiFC analyses revealed that the CIPK1 interacts with ECT1 in the outside of nucleus. Pull-down assays verified that CBL1 decreases the CIPK1-ECT1 interaction affinity. Phenotypic analyses of ect1 mutant demonstrated that the RPM1-dependent HR is abolished in the ect1 mutant. In addition, the ect1 mutant was hypersensitive to the A. brassicicola infection compared to the wild-type plant. Real time RT-PCR revealed that the expression of marker genes such as PR genes, GLIP1 gene, and PDF1.2 gene is decreased in the ect1 mutant upon A. brassicicola infection. Also induction of LOX, JA biosynthetic enzyme, is suppressed in ect1 mutant. Currently, we are analyzing quantity of JA in ect1 mutant.
CIPK1 interacts with a couple of calcineurin B-like (CBL) calcium sensors such as CBL1 and CBL9. Therefore it is believed that CIPK1 is also involved in a variety of stress signal transduction pathways which use Ca^(2+) as a second messenger. The ECT1 (evolutionarily conserved C-terminal region) gene in known as CIPK1 interacting partner that can be targeted into the nucleus. BiFC analyses revealed that the CIPK1 interacts with ECT1 in the outside of nucleus. Pull-down assays verified that CBL1 decreases the CIPK1-ECT1 interaction affinity. Phenotypic analyses of ect1 mutant demonstrated that the RPM1-dependent HR is abolished in the ect1 mutant. In addition, the ect1 mutant was hypersensitive to the A. brassicicola infection compared to the wild-type plant. Real time RT-PCR revealed that the expression of marker genes such as PR genes, GLIP1 gene, and PDF1.2 gene is decreased in the ect1 mutant upon A. brassicicola infection. Also induction of LOX, JA biosynthetic enzyme, is suppressed in ect1 mutant. Currently, we are analyzing quantity of JA in ect1 mutant.
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