[학위논문]사람 유방암세포에 대한 Maackia fauriei 수피 유래 렉틴의 특성 Characterization of a lectin obtained from the bark of Maackia fauriei on the human breast cancer cells원문보기
한국의 제주도에서 자생하는 솔비나무, Maackia fauriei로부터 시알산과 특이적으로 결합하는 렉틴을 정제하였고 종양 세포의 apoptosis유도 활성의 새로운 특성을 확인하였다. Maackia fauriei Agglutinin (MFA)이라 명명한 이 물질은 membrane filtration후에 fetuin-affinity 컬럼을 사용하여 정제하였다. MFA의 분자량은 전기영동과 gel ...
한국의 제주도에서 자생하는 솔비나무, Maackia fauriei로부터 시알산과 특이적으로 결합하는 렉틴을 정제하였고 종양 세포의 apoptosis유도 활성의 새로운 특성을 확인하였다. Maackia fauriei Agglutinin (MFA)이라 명명한 이 물질은 membrane filtration후에 fetuin-affinity 컬럼을 사용하여 정제하였다. MFA의 분자량은 전기영동과 gel filtration chromatograph를 통해 30kDa의 단량체로 구성된 tetramer임을 알 수 있었다. 적혈구 응집 반응 실험에서 MFA는 mouse의 적혈구와 응집하였으며 FITC conjugated MFA와 disulfide bond가 잘린 MFA에서 활성이 감소된 적혈구 응집반응을 보였다. 세가지의 사람 암세포(유방암, 폐암, 췌장암)에 CCK assay를 한 결과 MFA가 농도의존적으로 암세포를 사멸시킴을 확인하였고 유방암세포가 췌장암세포와 폐암세포보다 더 급속한 속도로 줄어드는 것을 확인하여 MFA가 유방암세포에 강력한 독성을 갖고 있음을 확인하였다. MCF-7 유방암 세포가 사멸하는 메커니즘을 형광현미경, 광학현미경, Flow cytometry, western blotting을 통해 확인하였다. MCF-7 세포는 여러 시간차를 두며 cell death를 일으키게 되었고 PI와 annexin V-FITC staining을 통한 FACS analysis를 통해 apoptosis를 측정하였다. Western blotting을 통해 세포사멸과정이 caspase-3 pathway를 통하는 것을 확인하였다. 형광현미경과 광학현미경을 통한 측정에서는 MFA가 세포질 내로 들어가 핵에 붙어서 세포 사멸을 일으키는 것을 관찰하였다. 또한 neuraminidase를 이용해 세포 표면의 sialyl epitope를 잘라낸 MCF-7에 대해서는 처리하지 않은 세포보다 반응이 약화되었음이 확인되어 MFA가 sialyl epitope를 인식하여 반응함을 확인하였다. MFARA는 약화된 hemagglutinin activity를 나타내었으며 암세포에는 거의 부착하지 못하는 것을 확인하였다. MFA의 당 조성을 측정한 결과 식물에서 유래한 단백질에 주로 많이 함유되어있는 arabinose와 xylose를 측정하였다. Circular dichroism으로 2차 구조를 측정해본 결과 disulfide bond가 절단되어 α-helix의 66%, β-turns 100%, random-coil structure 의 25% 정도가 β-sheet로 변성되었음을 알 수 있었고 이로 인해 구조가 활성에 큰 영향을 미침을 확인하였다. 결론적으로 본 연구에서는 제주도에서 자생하는 솔비나무에서 추출한 MFA 렉틴을 정제하고 세포독성을 확인하였으며 특히 유방암에 강하게 결합하며 apoptosis를 일으키는 활성과 기전을 찾아내었다. 또한, 식물에만 존재하는 특이한 monosaccharide인 arabinose와 xylose가 MFA의 당분석을 통해 검출되었다. 본 연구에서는 MFA가 사람암세포에 대해 활용가능성을 확인하였고, 유방암세포에 대한 항암제와 강한 결합력을 이용한 암세포 표적 마커로서의 개발 가능성을 제시하였다.
한국의 제주도에서 자생하는 솔비나무, Maackia fauriei로부터 시알산과 특이적으로 결합하는 렉틴을 정제하였고 종양 세포의 apoptosis유도 활성의 새로운 특성을 확인하였다. Maackia fauriei Agglutinin (MFA)이라 명명한 이 물질은 membrane filtration후에 fetuin-affinity 컬럼을 사용하여 정제하였다. MFA의 분자량은 전기영동과 gel filtration chromatograph를 통해 30kDa의 단량체로 구성된 tetramer임을 알 수 있었다. 적혈구 응집 반응 실험에서 MFA는 mouse의 적혈구와 응집하였으며 FITC conjugated MFA와 disulfide bond가 잘린 MFA에서 활성이 감소된 적혈구 응집반응을 보였다. 세가지의 사람 암세포(유방암, 폐암, 췌장암)에 CCK assay를 한 결과 MFA가 농도의존적으로 암세포를 사멸시킴을 확인하였고 유방암세포가 췌장암세포와 폐암세포보다 더 급속한 속도로 줄어드는 것을 확인하여 MFA가 유방암세포에 강력한 독성을 갖고 있음을 확인하였다. MCF-7 유방암 세포가 사멸하는 메커니즘을 형광현미경, 광학현미경, Flow cytometry, western blotting을 통해 확인하였다. MCF-7 세포는 여러 시간차를 두며 cell death를 일으키게 되었고 PI와 annexin V-FITC staining을 통한 FACS analysis를 통해 apoptosis를 측정하였다. Western blotting을 통해 세포사멸과정이 caspase-3 pathway를 통하는 것을 확인하였다. 형광현미경과 광학현미경을 통한 측정에서는 MFA가 세포질 내로 들어가 핵에 붙어서 세포 사멸을 일으키는 것을 관찰하였다. 또한 neuraminidase를 이용해 세포 표면의 sialyl epitope를 잘라낸 MCF-7에 대해서는 처리하지 않은 세포보다 반응이 약화되었음이 확인되어 MFA가 sialyl epitope를 인식하여 반응함을 확인하였다. MFARA는 약화된 hemagglutinin activity를 나타내었으며 암세포에는 거의 부착하지 못하는 것을 확인하였다. MFA의 당 조성을 측정한 결과 식물에서 유래한 단백질에 주로 많이 함유되어있는 arabinose와 xylose를 측정하였다. Circular dichroism으로 2차 구조를 측정해본 결과 disulfide bond가 절단되어 α-helix의 66%, β-turns 100%, random-coil structure 의 25% 정도가 β-sheet로 변성되었음을 알 수 있었고 이로 인해 구조가 활성에 큰 영향을 미침을 확인하였다. 결론적으로 본 연구에서는 제주도에서 자생하는 솔비나무에서 추출한 MFA 렉틴을 정제하고 세포독성을 확인하였으며 특히 유방암에 강하게 결합하며 apoptosis를 일으키는 활성과 기전을 찾아내었다. 또한, 식물에만 존재하는 특이한 monosaccharide인 arabinose와 xylose가 MFA의 당분석을 통해 검출되었다. 본 연구에서는 MFA가 사람암세포에 대해 활용가능성을 확인하였고, 유방암세포에 대한 항암제와 강한 결합력을 이용한 암세포 표적 마커로서의 개발 가능성을 제시하였다.
A lectin with biological functions such as sialic acid-binding specificity, potent mitogenic activity, and triggering apoptosis in cancer cells was isolated from the Maackia fauriei by membrane filtration, and affinity chromatography on fetuin-agarose. This lectin, designated MFA, is a tetramer prot...
A lectin with biological functions such as sialic acid-binding specificity, potent mitogenic activity, and triggering apoptosis in cancer cells was isolated from the Maackia fauriei by membrane filtration, and affinity chromatography on fetuin-agarose. This lectin, designated MFA, is a tetramer protein with a molecular mass of 30 kDa determined by SDS-PAGE under reducing and non-reducing conditions and gel filtration chromatography. MFA agglutinated mouse erythrocyte. RA treated MFA, FITC conjugated MFA, FITC conjugation at RA treated MFA is showed reduced hemagglutination activity. CCK assay on three human cancer(breast, lung, pancrease) cells, they have shown MFA induces cell death by dose-dependent manner. Especially, the viablilty of MCF-7 is strongly reduced by MFA than the other human cancer cells. The mechanism of MCF7 cell death was investigated using biological tools such as fluorescence microscope, optic microscope, flow cytometry and western blotting. MCF-7 cell death occurred various time exposure to the lectin and with signs of apoptosis, as analyzed by PI and annexin V-FITC staining. Investigation of the possible mediators of this process showed that cell death occurred by caspase-3 pathway. Fluorescein microscopy indicated MFA probably adsorbed to cytosol and bind to nucleus in mediating cell death. The result on the MCF-7, treated with neuraminidase, is lower sensitive at MFA than non-treated cells indicate that MFA recognize sialyl epitope and react with MCF-7. Circular dichroism data after MFA degeneration by cutting disulfide bonds showed that 66% of α-helix, all of β-turns, and 25% of random-coil turned to β-sheet. The structural change of MFA may results in the decrease of some biological functions such as hemagglutination and cytotoxic activity. Arabinose and xylose that are specific monosaccharide on the plant glycoproteins were detected from the carbohydrate analysis of MFA. In conclusion, MFA is one of the useful protein to human cancer cells, and provide a potential possibility of anticancer agent and target-marker of breast cancer cells.
A lectin with biological functions such as sialic acid-binding specificity, potent mitogenic activity, and triggering apoptosis in cancer cells was isolated from the Maackia fauriei by membrane filtration, and affinity chromatography on fetuin-agarose. This lectin, designated MFA, is a tetramer protein with a molecular mass of 30 kDa determined by SDS-PAGE under reducing and non-reducing conditions and gel filtration chromatography. MFA agglutinated mouse erythrocyte. RA treated MFA, FITC conjugated MFA, FITC conjugation at RA treated MFA is showed reduced hemagglutination activity. CCK assay on three human cancer(breast, lung, pancrease) cells, they have shown MFA induces cell death by dose-dependent manner. Especially, the viablilty of MCF-7 is strongly reduced by MFA than the other human cancer cells. The mechanism of MCF7 cell death was investigated using biological tools such as fluorescence microscope, optic microscope, flow cytometry and western blotting. MCF-7 cell death occurred various time exposure to the lectin and with signs of apoptosis, as analyzed by PI and annexin V-FITC staining. Investigation of the possible mediators of this process showed that cell death occurred by caspase-3 pathway. Fluorescein microscopy indicated MFA probably adsorbed to cytosol and bind to nucleus in mediating cell death. The result on the MCF-7, treated with neuraminidase, is lower sensitive at MFA than non-treated cells indicate that MFA recognize sialyl epitope and react with MCF-7. Circular dichroism data after MFA degeneration by cutting disulfide bonds showed that 66% of α-helix, all of β-turns, and 25% of random-coil turned to β-sheet. The structural change of MFA may results in the decrease of some biological functions such as hemagglutination and cytotoxic activity. Arabinose and xylose that are specific monosaccharide on the plant glycoproteins were detected from the carbohydrate analysis of MFA. In conclusion, MFA is one of the useful protein to human cancer cells, and provide a potential possibility of anticancer agent and target-marker of breast cancer cells.
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