본 연구에서는 가역반응성 항체를 이용하여 연속탐지용 면역센서를 구축하였다. 기존의 면역분석 및 면역센서는 한 번 항원-항체 결합체가 형성되면 해리가 되지 않는 탈착속도가 낮은 항체를 사용하였는데 이는 비반응물질을 분리하기 위한 세척과정 중 결합체가 유실되지 않기 위함이다. 따라서 이러한 면역분석은 근본적으로 재활용 및 연속탐지가 불가능하다. 이러한 연속탐지에 있어서 기존의 면역분석의 단점을 해결하기 위해 새로운 반응특성의 가역반응성 항체를 선별하였고 연속탐지를 위한 센서 응답예측을 위해 수학모델링을 실시하였으며 궁극적으로 가역반응성 항체를 이용하여 연속탐지용 면역센서를 구축하여 실제 모의실험을 실시함으로써 진단용으로써의 가능성과 한계점을 규명하였다.
가역반응성의 항체는 전통적인 면역분석에 사용되었던 비가역반응성 항체와 달리 재활용이 가능한 항체로써 항원-항체 면역결합체 형성 즉시 자연적으로 해리되는 특성으로 분석물질의 농도에 비례하여 자연적으로 신호 발생이 가능하게 하는 항체이다. 본 연구에서는 Surface plasmon resonance(...
본 연구에서는 가역반응성 항체를 이용하여 연속탐지용 면역센서를 구축하였다. 기존의 면역분석 및 면역센서는 한 번 항원-항체 결합체가 형성되면 해리가 되지 않는 탈착속도가 낮은 항체를 사용하였는데 이는 비반응물질을 분리하기 위한 세척과정 중 결합체가 유실되지 않기 위함이다. 따라서 이러한 면역분석은 근본적으로 재활용 및 연속탐지가 불가능하다. 이러한 연속탐지에 있어서 기존의 면역분석의 단점을 해결하기 위해 새로운 반응특성의 가역반응성 항체를 선별하였고 연속탐지를 위한 센서 응답예측을 위해 수학모델링을 실시하였으며 궁극적으로 가역반응성 항체를 이용하여 연속탐지용 면역센서를 구축하여 실제 모의실험을 실시함으로써 진단용으로써의 가능성과 한계점을 규명하였다.
가역반응성의 항체는 전통적인 면역분석에 사용되었던 비가역반응성 항체와 달리 재활용이 가능한 항체로써 항원-항체 면역결합체 형성 즉시 자연적으로 해리되는 특성으로 분석물질의 농도에 비례하여 자연적으로 신호 발생이 가능하게 하는 항체이다. 본 연구에서는 Surface plasmon resonance(SPR) 센서를 이용한 스크리닝방법으로 가역반응성의 α2-macroglobulin 항원에 대한 항체를 1종(1B5, ka = 4.13x106 L·mol-1·sec-1 and kd = 3.61x10-3 sec-1) 얻었다. 항체의 특성을 비교하기 위해 기존 면역분석에 사용되었던 비가역반응성 항체(20E7, ka = 7.97x103 L·mol-1·sec-1, kd = 8.17x10-5 sec-1)와 가역반응성 항체를 비교하였다. 비가역반응성 항체는 각 단계마다 탈착이 이루어지지 않아 신호가 누적되어 계단형태로 증가하는 것을 관찰할 수 있었고 가역반응성 항체는 각 단계마다 초기상태까지 탈착이 원활하게 이루어지는 재현성을 나타내었다. 항체의 친화력 테스트에서는 분석에 사용된 항체농도 범위 내에서 SPR 센서의 신호가 계단식으로 단계적으로 증가 및 감소하였으며 또한 농도범위가 pg/mL 이하에서도 고정된 항원과 반응하여 센서의 신호가 검출되는 것으로 나타났다. 또한 pg 농도단위에서 μg 단위까지 반응성이 넓게 나타났고 탈착반응도 모든 각 농도에서 완벽히 이루어진 것을 알 수 있었다. 넓은 반응 농도 범위 및 낮은 검출 한계로부터 이 항체가 측정용 센서로 사용하기에 적합하다는 것을 알 수 있었다.
가역반응성 항체를 연속탐지용 면역센서에 사용하기에 앞서 연속탐지가 가능한지를 예측하기 위해 수학모델링을 시행하였다. 수학모델링은 SPR 센서의 분석시스템 상에서 일어나는 항원-항체 반응을 기본 모델로 사용하여 Matlab 프로그램으로 실험모델을 해석하고 수학모사를 실시하였다. 구축된 수학모사를 사용하여 앞서 시행하였던 항체 특성화 실험 결과에서 사용되었던 실험 조건들을 수학모사에 대입하여 결과를 예측하였고 실험 결과와 비교하였다. 그 결과 모든 결과들은 정확도가 90% 이상을 나타내었고 높은 정확도를 근거로 실제 연속탐지가 가능하다는 것을 알 수 있었다.
앞서 수행했던 수학모델링을 통해 확인되었던 연속탐지의 이론적 결과를 실제 실험을 통해 확인하였고 분석특성을 규명하였다. 분석민감도 시험결과 0.1 ng/mL의 α2-macroglobulin 항원을 탐지할 수 있는 것으로 나타났고 분석특이성 시험결과에서는 시료운반용액이 인간 혈청이었을 때도 인산완충용액(PBS)와 마찬가지로 신호응답을 보이는 것으로 확인되었다. 공통적인 분석 특징으로는 부착단계에서의 평형에 도달하는 시간이 탈착단계에서의 평형에 도달하는 시간보다 빠른 것으로 나타났다. 센서의 응답시간은 신호가 평형에 도달했을 때 그 신호의 95%에 해당하는 시간으로 측정하면 농도에 따라 다르지만 약 400-1,000 초 사이인 것으로 나타났다. 이러한 센서의 분석특성을 규명함으로써 위 센서가 실시간 연속탐지가 가능하다는 것을 알 수 있었다.
최적조건들을 도출하여 급성질환 진단을 목적으로 하는 모의 임상 연속탐지를 실시하였다. 분석특성 시험 결과, 이론적 및 실험적 결과로부터 지수적 또는 산술적 농도변화에서 센서가 각 구간의 농도 마다 차이를 보이며 응답하는 것을 관찰할 수 있었고 누적된 실험결과를 통해 센서의 사용기간이 한 달이 지남에도 초기신호가 95% 이상 유지되는 것을 관찰할 수 있었다. 이를 통해 실제 급성질환 중 하나인 심근경색의 바이오마커로서 작용하는 CK-MB의 발병전후 약 3일 간의 농도변화 관찰을 연속탐지용 면역센서를 이용하여 실험적으로 모사하였다. 그 결과 실제 주입된 농도는 큰 유실없이 SPR 신호로 나타난 것으로 확인되었고 SPR 신호와 정량결과로부터 심근경색 발병농도인 5 ng/mL에서의 시간차는 17분으로 계산되었다. 이러한 모의 실험결과는 실제 심근경색 증상으로 인한 병원 방문시 연속탐지 면역센서를 장착하게 되면 바이오마커가 심근경색이라고 확진을 할 수 있는 농도에 도달했을 때 17분 안으로 환자나 의사에게 경고를 할 수 있다는 것을 뜻하고 조기치료를 하여 건강을 유지할 수 있다는 것을 뜻한다.
결론으로 가역반응성 항체 기반의 연속탐지용 면역센서는 기존의 면역분석에서 사용되던 항체를 탈피하여 새로운 반응성을 가진 항체를 사용함으로써 높은 민감도와 빠른 응답성에 따른 기존의 면역분석이 가지고 있는 장점을 고스란히 가질 수 있었고 이러한 분석민감도와 특이도의 감소없이 자연스러운 초기상태로의 회귀 특성 또한 가질 수 있었다. 따라서 기존 면역분석의 단점으로 지적되었던 재활용이 불가능하다는 것을 가능하게 만들었다. 또한 비표지 센서를 사용함으로써 연속탐지를 효율적으로 수행할 수 있었고 차후 소형센서 개발 시 분석시스템을 획기적으로 단순화 시킬 수 있는 가능성을 보여주었다. 마지막으로 모의 임상실험을 통하여 장기간 동안 항체의 재활용을 이용한 연속진단의 예시를 보여줌으로써 실제 의료진단에서의 적용가능성과 미래 U-헬스케어 기반의 건강관리 기반기술 확립에 다가갈 수 있는 새로운 진단패러다임의 길을 열었다고 할 수 있다.
본 연구에서는 가역반응성 항체를 이용하여 연속탐지용 면역센서를 구축하였다. 기존의 면역분석 및 면역센서는 한 번 항원-항체 결합체가 형성되면 해리가 되지 않는 탈착속도가 낮은 항체를 사용하였는데 이는 비반응물질을 분리하기 위한 세척과정 중 결합체가 유실되지 않기 위함이다. 따라서 이러한 면역분석은 근본적으로 재활용 및 연속탐지가 불가능하다. 이러한 연속탐지에 있어서 기존의 면역분석의 단점을 해결하기 위해 새로운 반응특성의 가역반응성 항체를 선별하였고 연속탐지를 위한 센서 응답예측을 위해 수학모델링을 실시하였으며 궁극적으로 가역반응성 항체를 이용하여 연속탐지용 면역센서를 구축하여 실제 모의실험을 실시함으로써 진단용으로써의 가능성과 한계점을 규명하였다.
가역반응성의 항체는 전통적인 면역분석에 사용되었던 비가역반응성 항체와 달리 재활용이 가능한 항체로써 항원-항체 면역결합체 형성 즉시 자연적으로 해리되는 특성으로 분석물질의 농도에 비례하여 자연적으로 신호 발생이 가능하게 하는 항체이다. 본 연구에서는 Surface plasmon resonance(SPR) 센서를 이용한 스크리닝방법으로 가역반응성의 α2-macroglobulin 항원에 대한 항체를 1종(1B5, ka = 4.13x106 L·mol-1·sec-1 and kd = 3.61x10-3 sec-1) 얻었다. 항체의 특성을 비교하기 위해 기존 면역분석에 사용되었던 비가역반응성 항체(20E7, ka = 7.97x103 L·mol-1·sec-1, kd = 8.17x10-5 sec-1)와 가역반응성 항체를 비교하였다. 비가역반응성 항체는 각 단계마다 탈착이 이루어지지 않아 신호가 누적되어 계단형태로 증가하는 것을 관찰할 수 있었고 가역반응성 항체는 각 단계마다 초기상태까지 탈착이 원활하게 이루어지는 재현성을 나타내었다. 항체의 친화력 테스트에서는 분석에 사용된 항체농도 범위 내에서 SPR 센서의 신호가 계단식으로 단계적으로 증가 및 감소하였으며 또한 농도범위가 pg/mL 이하에서도 고정된 항원과 반응하여 센서의 신호가 검출되는 것으로 나타났다. 또한 pg 농도단위에서 μg 단위까지 반응성이 넓게 나타났고 탈착반응도 모든 각 농도에서 완벽히 이루어진 것을 알 수 있었다. 넓은 반응 농도 범위 및 낮은 검출 한계로부터 이 항체가 측정용 센서로 사용하기에 적합하다는 것을 알 수 있었다.
가역반응성 항체를 연속탐지용 면역센서에 사용하기에 앞서 연속탐지가 가능한지를 예측하기 위해 수학모델링을 시행하였다. 수학모델링은 SPR 센서의 분석시스템 상에서 일어나는 항원-항체 반응을 기본 모델로 사용하여 Matlab 프로그램으로 실험모델을 해석하고 수학모사를 실시하였다. 구축된 수학모사를 사용하여 앞서 시행하였던 항체 특성화 실험 결과에서 사용되었던 실험 조건들을 수학모사에 대입하여 결과를 예측하였고 실험 결과와 비교하였다. 그 결과 모든 결과들은 정확도가 90% 이상을 나타내었고 높은 정확도를 근거로 실제 연속탐지가 가능하다는 것을 알 수 있었다.
앞서 수행했던 수학모델링을 통해 확인되었던 연속탐지의 이론적 결과를 실제 실험을 통해 확인하였고 분석특성을 규명하였다. 분석민감도 시험결과 0.1 ng/mL의 α2-macroglobulin 항원을 탐지할 수 있는 것으로 나타났고 분석특이성 시험결과에서는 시료운반용액이 인간 혈청이었을 때도 인산완충용액(PBS)와 마찬가지로 신호응답을 보이는 것으로 확인되었다. 공통적인 분석 특징으로는 부착단계에서의 평형에 도달하는 시간이 탈착단계에서의 평형에 도달하는 시간보다 빠른 것으로 나타났다. 센서의 응답시간은 신호가 평형에 도달했을 때 그 신호의 95%에 해당하는 시간으로 측정하면 농도에 따라 다르지만 약 400-1,000 초 사이인 것으로 나타났다. 이러한 센서의 분석특성을 규명함으로써 위 센서가 실시간 연속탐지가 가능하다는 것을 알 수 있었다.
최적조건들을 도출하여 급성질환 진단을 목적으로 하는 모의 임상 연속탐지를 실시하였다. 분석특성 시험 결과, 이론적 및 실험적 결과로부터 지수적 또는 산술적 농도변화에서 센서가 각 구간의 농도 마다 차이를 보이며 응답하는 것을 관찰할 수 있었고 누적된 실험결과를 통해 센서의 사용기간이 한 달이 지남에도 초기신호가 95% 이상 유지되는 것을 관찰할 수 있었다. 이를 통해 실제 급성질환 중 하나인 심근경색의 바이오마커로서 작용하는 CK-MB의 발병전후 약 3일 간의 농도변화 관찰을 연속탐지용 면역센서를 이용하여 실험적으로 모사하였다. 그 결과 실제 주입된 농도는 큰 유실없이 SPR 신호로 나타난 것으로 확인되었고 SPR 신호와 정량결과로부터 심근경색 발병농도인 5 ng/mL에서의 시간차는 17분으로 계산되었다. 이러한 모의 실험결과는 실제 심근경색 증상으로 인한 병원 방문시 연속탐지 면역센서를 장착하게 되면 바이오마커가 심근경색이라고 확진을 할 수 있는 농도에 도달했을 때 17분 안으로 환자나 의사에게 경고를 할 수 있다는 것을 뜻하고 조기치료를 하여 건강을 유지할 수 있다는 것을 뜻한다.
결론으로 가역반응성 항체 기반의 연속탐지용 면역센서는 기존의 면역분석에서 사용되던 항체를 탈피하여 새로운 반응성을 가진 항체를 사용함으로써 높은 민감도와 빠른 응답성에 따른 기존의 면역분석이 가지고 있는 장점을 고스란히 가질 수 있었고 이러한 분석민감도와 특이도의 감소없이 자연스러운 초기상태로의 회귀 특성 또한 가질 수 있었다. 따라서 기존 면역분석의 단점으로 지적되었던 재활용이 불가능하다는 것을 가능하게 만들었다. 또한 비표지 센서를 사용함으로써 연속탐지를 효율적으로 수행할 수 있었고 차후 소형센서 개발 시 분석시스템을 획기적으로 단순화 시킬 수 있는 가능성을 보여주었다. 마지막으로 모의 임상실험을 통하여 장기간 동안 항체의 재활용을 이용한 연속진단의 예시를 보여줌으로써 실제 의료진단에서의 적용가능성과 미래 U-헬스케어 기반의 건강관리 기반기술 확립에 다가갈 수 있는 새로운 진단패러다임의 길을 열었다고 할 수 있다.
We constructed a reversibly reactive antibody-based immunosensor that can perform continuous monitoring for analyte. In most immunosensor using an immobilized antibody as the binder, an antibody with irreversible binding characteristic is used since excess reagents, after antigen-antibody binding, h...
We constructed a reversibly reactive antibody-based immunosensor that can perform continuous monitoring for analyte. In most immunosensor using an immobilized antibody as the binder, an antibody with irreversible binding characteristic is used since excess reagents, after antigen-antibody binding, have to be washed away from the solid surfaces. Therefore, the immunosensor essentially impossible to recycle, and continuous measurements. To resolve disadvantage of immunosensor in continuous monitoring, we also screened the reversibly reactive antibody of new reaction characteristic and conducted mathematical modeling to predicted response of immunosensor for continuous monitoring. Finally, we tested continuous monitoring using a reversibly reactive antibody to actual simulation test and we identified possibility and limitation for clinical diagnosis.
Unlike the irreversibly reactive antibody in traditional immunosensor, reversibly reactive antibody is possible to recycle, it is an antigen-antibody immuno-complex naturally formed immediately to analyze the attributes that are dissociated in proportion to the concentration of analyte can occur naturally. We have produced monoclonal antibodies having high rate constants in the both of association (ka) and dissociation (kd) reaction with a target analyte(e.g., α2-macroglobulin) in order to maintain a high equilibrium association constant(KA = ka/kd) by surface plasmon resonance screening(1B5, ka = 4.13x106 L·mol-1·sec-1 and kd = 3.61x10-3 sec-1). To compare the characteristics of the irreversibly reactive antibody(20E7, ka = 7.97x103 L·mol-1·sec-1, kd = 8.17x10-5 sec-1) was used to most immunosensor and reversibly reactive antibody were compared. In the binding pattern, the antibody showed a complete, repetitive association/dissociation in total 6 cycles in a neutral pH medium. On the other hand, the conventional, irreversible antibody was not able to complete, particularly, the dissociation during the identical time interval, which, thus, continued to accumulate the binding complexes each cycle. In affinity test of antibody, we determined the antibody concentration minimally detectable using the sensor to be 0.5 pg/mL that was relatively small to those of other antibodies conventionally used. In addition, the concentration unit pg μg responsive to the concentration unit widely dissociated reaction reflects that all could see the depth of fully. These results indicated that the antibody showing a reversible binding characteristic and high affinity can be used for the continuous monitoring of analyte concentration in the fields.
Previously, using reversibly reactive antibody to the immunosensor is possible to predict the continuous monitoring were carried out for the mathematical modeling. Mathematical modeling was used antigen-antibody reaction to the basic model on analytical system of the SPR sensor, the experimental model interpreted by Matlab program and prediction program constructed by Matlab graphic user interface(GUI). Using the prediction program, theoretical result predicted by substitute a previously experimental condition that were compare with experimental result. As a result, all results indicate that more than 90% accuracy and high accuracy could be possible to know the actual continuous monitoring.
The mathematical modeling was performed to confirm the theoretical results of continuous measurements were confirmed by the actual experiment and to reach optimal conditions for the diagnosis of acute disease, conducted continuous monitoring simulation. From theoretical and experimental results exponential or arithmetic changes in concentration of each segment differ from the sensors to observe the response could be expected to. Sensor through the use of the accumulated results of the experiment over a month period to 95% more than the initial signal was observed to be maintained. As a result, acute myocardial infarction, one of the actual disease, as a function of CK-MB of biomarkers was simulated using by immunosensor during before and after the onset of about 3 consecutive days to observe changes in the concentration. As a result, the actual concentration of the injected without loss of the SPR signal was confirmed. From SPR signals and quantitative results, cut-off concentration of myocardial infarction 5 ng/mL in 17 minutes time difference was calculated. These simulation results, during visit to the hospital due to the actual symptoms of myocardial infarction when mounting the immunosensor, biomarkers as a myocardial infarction can be diagnosed when it reaches a concentration of 17 minutes in a warning to patients or doctors can do early treatment of stands that can maintain the health means.
In conclusions, reversibly reactive antibody based-immunosensor for continuous monitoring was by using an antibody with a new responsiveness, have high sensitivity and fast response. In addition, the natural characteristics of the regression to initial state could have also without reduced sensitivity and specificity. Therefore, as pointed out the disadvantage of the existing immunosensor was made possible recycling is impossible. In addition, by using label-free continuous monitoring sensor could be performed efficiently. Also, analysis system for development of small sensors that can dramatically simplify showed. Finally, through simulation, using a continuous recycling of the antibody for a long time to diagnosis by showing an example of the possibility of actual applied in medical diagnosis and the future of health care-based U-healthcare-based approach to establishing the way of a new diagnostic paradigm that can be opened.
We constructed a reversibly reactive antibody-based immunosensor that can perform continuous monitoring for analyte. In most immunosensor using an immobilized antibody as the binder, an antibody with irreversible binding characteristic is used since excess reagents, after antigen-antibody binding, have to be washed away from the solid surfaces. Therefore, the immunosensor essentially impossible to recycle, and continuous measurements. To resolve disadvantage of immunosensor in continuous monitoring, we also screened the reversibly reactive antibody of new reaction characteristic and conducted mathematical modeling to predicted response of immunosensor for continuous monitoring. Finally, we tested continuous monitoring using a reversibly reactive antibody to actual simulation test and we identified possibility and limitation for clinical diagnosis.
Unlike the irreversibly reactive antibody in traditional immunosensor, reversibly reactive antibody is possible to recycle, it is an antigen-antibody immuno-complex naturally formed immediately to analyze the attributes that are dissociated in proportion to the concentration of analyte can occur naturally. We have produced monoclonal antibodies having high rate constants in the both of association (ka) and dissociation (kd) reaction with a target analyte(e.g., α2-macroglobulin) in order to maintain a high equilibrium association constant(KA = ka/kd) by surface plasmon resonance screening(1B5, ka = 4.13x106 L·mol-1·sec-1 and kd = 3.61x10-3 sec-1). To compare the characteristics of the irreversibly reactive antibody(20E7, ka = 7.97x103 L·mol-1·sec-1, kd = 8.17x10-5 sec-1) was used to most immunosensor and reversibly reactive antibody were compared. In the binding pattern, the antibody showed a complete, repetitive association/dissociation in total 6 cycles in a neutral pH medium. On the other hand, the conventional, irreversible antibody was not able to complete, particularly, the dissociation during the identical time interval, which, thus, continued to accumulate the binding complexes each cycle. In affinity test of antibody, we determined the antibody concentration minimally detectable using the sensor to be 0.5 pg/mL that was relatively small to those of other antibodies conventionally used. In addition, the concentration unit pg μg responsive to the concentration unit widely dissociated reaction reflects that all could see the depth of fully. These results indicated that the antibody showing a reversible binding characteristic and high affinity can be used for the continuous monitoring of analyte concentration in the fields.
Previously, using reversibly reactive antibody to the immunosensor is possible to predict the continuous monitoring were carried out for the mathematical modeling. Mathematical modeling was used antigen-antibody reaction to the basic model on analytical system of the SPR sensor, the experimental model interpreted by Matlab program and prediction program constructed by Matlab graphic user interface(GUI). Using the prediction program, theoretical result predicted by substitute a previously experimental condition that were compare with experimental result. As a result, all results indicate that more than 90% accuracy and high accuracy could be possible to know the actual continuous monitoring.
The mathematical modeling was performed to confirm the theoretical results of continuous measurements were confirmed by the actual experiment and to reach optimal conditions for the diagnosis of acute disease, conducted continuous monitoring simulation. From theoretical and experimental results exponential or arithmetic changes in concentration of each segment differ from the sensors to observe the response could be expected to. Sensor through the use of the accumulated results of the experiment over a month period to 95% more than the initial signal was observed to be maintained. As a result, acute myocardial infarction, one of the actual disease, as a function of CK-MB of biomarkers was simulated using by immunosensor during before and after the onset of about 3 consecutive days to observe changes in the concentration. As a result, the actual concentration of the injected without loss of the SPR signal was confirmed. From SPR signals and quantitative results, cut-off concentration of myocardial infarction 5 ng/mL in 17 minutes time difference was calculated. These simulation results, during visit to the hospital due to the actual symptoms of myocardial infarction when mounting the immunosensor, biomarkers as a myocardial infarction can be diagnosed when it reaches a concentration of 17 minutes in a warning to patients or doctors can do early treatment of stands that can maintain the health means.
In conclusions, reversibly reactive antibody based-immunosensor for continuous monitoring was by using an antibody with a new responsiveness, have high sensitivity and fast response. In addition, the natural characteristics of the regression to initial state could have also without reduced sensitivity and specificity. Therefore, as pointed out the disadvantage of the existing immunosensor was made possible recycling is impossible. In addition, by using label-free continuous monitoring sensor could be performed efficiently. Also, analysis system for development of small sensors that can dramatically simplify showed. Finally, through simulation, using a continuous recycling of the antibody for a long time to diagnosis by showing an example of the possibility of actual applied in medical diagnosis and the future of health care-based U-healthcare-based approach to establishing the way of a new diagnostic paradigm that can be opened.
AI-Helper
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