바실러스 서브틸리스의 DEAD-box RNA helicase 유전자들의 knock out 돌연변이체 제조 및 특성에 대한 연구 Construction and characterization of knock-out mutants of DEAD-box RNA helicase gene in Bacillus subtilis.원문보기
Bacillus subtilis에는 4개의 DEAD-box RNA helicase인 YdbR, YqfR, DeaD, YfmL이 있다. knock out mutant를 제조하기 위해 야생형 균주인 Cu1065에서 double joning PCR을 이용해서 각각의 유전자를 knock out하였다. 이들의 knock out mutant cell의 저온 민감성을 알아보기 위해 저온과 고온에서 RNA helicase인 YdbR, YqfR, DeaD, YfmL이 있다. knock out mutant를 제조하기 위해 야생형 균주인 Cu1065에서 double joning PCR을 이용해서 각각의 유전자를 knock out하였다. 이들의 knock out mutant cell의 저온 민감성을 알아보기 위해 저온과 고온에서 LB 배지를 사용하여 cell growth을 측정하였다. Single mutant들은 37℃에서 야생형 균주에 비해 대체로 잘 생장하였는데, 예외로 YdbR은 더딘 생장을 보였다. 22℃에서는 야생형 균주보다 모든 single mutant 세포들이 모두 더딘 생장을 보이는데, 이중 YdbR이 가장 더딘 생장을 보였고, YfmL, YqfR, DeaD 순으로 생장속도가 느렸다. double mutant 세포는 42℃에서 야생형 균주와 비슷한 생장을 보였고, 37℃에서는 야생형 균주에 비해 mutant 세포들이 더딘 생장을 보였지만 그중에서 YfmL/YdbR double mutant는 더욱 더딘 생장을 보였다. 22℃에서는 야생형균주에 비해 double mutant 세포들이 모두 더딘 생장을 확인하였다. triple 과 quadruple mutant세포들도 42℃에서 야생형 균주와 비슷한 생장을 보였고, 37℃에서도 야생형 균주보다 더딘 생장을 보였는데, 그중 YfmL/YdbR/DeaD triple mutant 가 가장 더딘 생장을 보였다. 22℃에서는 모든 mutant 세포들이 다 더딘 생장을 보였다. 최소배지를 사용한 22℃에서도 LB 배지 와 비슷한 생장곡선을 확인하였다. Cold shock 생장을 알아보기 위해 37℃에서 OD_(600)=0.5까지 배양한 후 15℃로 온도를 급격히 낮추어 cell growth를 실행하였다. 결과 여기서도 LB broth 와 같이 YdbR이 가장 생장하지 못하는 걸 확인하였다. minimal media 에서도 37℃에서 OD600=0.5까지 배양한 후 15℃로 저온 충격을 준 후 cell growth를 실행한 결과 최소배지에서도 역시 YdbR만이 잘 생장하지 못하는 것을 확인하였다. 저온에서 발현되는 유전자를 확인하기 위해 CU1065를 37℃와 22℃에서 각 각 0.5까지 배양한 후 RNA를 추출하여 northern blot을 시행한 결과 저온 에서 잘 생장하지 못하였던 YdbR에서 진하게 발현된 밴드를 확인하였다. YqfR 에서도 약하지만 22℃에서 밴드를 확인하였다. 또한 37℃에서 15℃로 저온 충격을 준 후 RNA를 추출하여 northern blot을 시행한 결과 여기서도 YdbR만이 현 된 것을 확인하였다. Cu1065를 37℃에서 OD600=0.5까지 배양 한 후 Rifampicin를 처리하여 일정시간후 세포를 수확하거나 15℃로 cold shock를 주고 Rifampicin을 처리하여 계속 15℃에 배양한 다음 일정 시간 후에 세포를 수확하였다. 세포내의 RNA를 추출하여 Northern blot을 시행한 결과 37℃에서는 밴드가 급격히 없어진 반면에, 15℃로 키운 세포는 37℃로 키운 것과는 달리 RNA가 계속 진하게 유지 하는 것을 확인하였다. 이는 Rifampicin에 의한 RNA 합성 억제에도 15℃에서는 YdbR RNA가 안정하게 유지되는 반면 37℃에서는 불안정하여 분해되는 것임을 알 수 있었다. Bacillus subtilis 4가지 DEAD - box RNA helicase 유전자들을 cloning 하였고 효소들을 분리하였다. 이들의 생화학적 특성을 알아보기 위해 더 연구가 진행되어야 할 것이다.
Bacillus subtilis에는 4개의 DEAD-box RNA helicase인 YdbR, YqfR, DeaD, YfmL이 있다. knock out mutant를 제조하기 위해 야생형 균주인 Cu1065에서 double joning PCR을 이용해서 각각의 유전자를 knock out하였다. 이들의 knock out mutant cell의 저온 민감성을 알아보기 위해 저온과 고온에서 LB 배지를 사용하여 cell growth을 측정하였다. Single mutant들은 37℃에서 야생형 균주에 비해 대체로 잘 생장하였는데, 예외로 YdbR은 더딘 생장을 보였다. 22℃에서는 야생형 균주보다 모든 single mutant 세포들이 모두 더딘 생장을 보이는데, 이중 YdbR이 가장 더딘 생장을 보였고, YfmL, YqfR, DeaD 순으로 생장속도가 느렸다. double mutant 세포는 42℃에서 야생형 균주와 비슷한 생장을 보였고, 37℃에서는 야생형 균주에 비해 mutant 세포들이 더딘 생장을 보였지만 그중에서 YfmL/YdbR double mutant는 더욱 더딘 생장을 보였다. 22℃에서는 야생형균주에 비해 double mutant 세포들이 모두 더딘 생장을 확인하였다. triple 과 quadruple mutant세포들도 42℃에서 야생형 균주와 비슷한 생장을 보였고, 37℃에서도 야생형 균주보다 더딘 생장을 보였는데, 그중 YfmL/YdbR/DeaD triple mutant 가 가장 더딘 생장을 보였다. 22℃에서는 모든 mutant 세포들이 다 더딘 생장을 보였다. 최소배지를 사용한 22℃에서도 LB 배지 와 비슷한 생장곡선을 확인하였다. Cold shock 생장을 알아보기 위해 37℃에서 OD_(600)=0.5까지 배양한 후 15℃로 온도를 급격히 낮추어 cell growth를 실행하였다. 결과 여기서도 LB broth 와 같이 YdbR이 가장 생장하지 못하는 걸 확인하였다. minimal media 에서도 37℃에서 OD600=0.5까지 배양한 후 15℃로 저온 충격을 준 후 cell growth를 실행한 결과 최소배지에서도 역시 YdbR만이 잘 생장하지 못하는 것을 확인하였다. 저온에서 발현되는 유전자를 확인하기 위해 CU1065를 37℃와 22℃에서 각 각 0.5까지 배양한 후 RNA를 추출하여 northern blot을 시행한 결과 저온 에서 잘 생장하지 못하였던 YdbR에서 진하게 발현된 밴드를 확인하였다. YqfR 에서도 약하지만 22℃에서 밴드를 확인하였다. 또한 37℃에서 15℃로 저온 충격을 준 후 RNA를 추출하여 northern blot을 시행한 결과 여기서도 YdbR만이 현 된 것을 확인하였다. Cu1065를 37℃에서 OD600=0.5까지 배양 한 후 Rifampicin를 처리하여 일정시간후 세포를 수확하거나 15℃로 cold shock를 주고 Rifampicin을 처리하여 계속 15℃에 배양한 다음 일정 시간 후에 세포를 수확하였다. 세포내의 RNA를 추출하여 Northern blot을 시행한 결과 37℃에서는 밴드가 급격히 없어진 반면에, 15℃로 키운 세포는 37℃로 키운 것과는 달리 RNA가 계속 진하게 유지 하는 것을 확인하였다. 이는 Rifampicin에 의한 RNA 합성 억제에도 15℃에서는 YdbR RNA가 안정하게 유지되는 반면 37℃에서는 불안정하여 분해되는 것임을 알 수 있었다. Bacillus subtilis 4가지 DEAD - box RNA helicase 유전자들을 cloning 하였고 효소들을 분리하였다. 이들의 생화학적 특성을 알아보기 위해 더 연구가 진행되어야 할 것이다.
There are four DEAD-box RNA helicases (YdbR, YqFr, DeaD, YfmL) in Bacillus subtilis. The deletion mutants of YdbR, YqFr, DeaD, and YfmL were constructed by DJ-PCR (Double Joint PCR) method. The knock out mutants were prepared with B. subtilis wild type Cu1065. Growth rate of DYqfR, DDeaD, and DYfmL ...
There are four DEAD-box RNA helicases (YdbR, YqFr, DeaD, YfmL) in Bacillus subtilis. The deletion mutants of YdbR, YqFr, DeaD, and YfmL were constructed by DJ-PCR (Double Joint PCR) method. The knock out mutants were prepared with B. subtilis wild type Cu1065. Growth rate of DYqfR, DDeaD, and DYfmL are nearly same compared with the growth of the wild type at 37℃. with LB complete media. On the other hands, the deletion mutant of YdbR showed reduced growth rate compared with the wild type. And DYdbR, DYqfR, DDeaD, and DYfmL showed slower growth rate compared with wild type at 22℃. In particular, the growth of YdbR null mutant is not well. The double deletion mutants of four genes (YdbR, YqFr, DeaD, and YfmL) showed reduced growth compared to the wild type at 22℃ and 37℃, While the double mutants showed nearly same growth rate compared to the wild type at 42℃. Specially, DYdbR/DYfmL double mutant showed the slowest growth rate. The growth of triple or quadruple deletion mutants also showed similar results at 22℃, 37℃ and 42℃. The same measurement of growth rate were tried with minimal media and all confirmed the same results compared to the results with LB complete media. For growth analysis of mutants by cold shock, we cultured cell with minimal or complete media at 37℃ and then transfer to cold condition. Among the four single deletion mutants, DYdbR showed the slowest growth rate in cold low shock conditions. To identify the gene expression at lower temperature (22℃). We tried Northern blot analysis after cultivation of Cu1065 cell at 37℃ or 22℃, the purified RNA were analyzed and showed that YdbR is strongly induced and YqfR is moderately induced at 22℃. Also, the cold shock experiment (cultivation of the cell at 37℃ and time variated cold shock at 22℃) confirmed that YdbR is strongly induced by cold shock. After cultivation of Cu1065 at 37℃(OD_(600)=0.5), the cells were treated with rifampicin at 37℃ or 15℃. and Northern blot analysis were tried. In this experiment, YdbR mRNA was sharply disappear at 37℃, but a lot of amount of YdbR mRNA was still existed at 22℃. This means that although transcription is inhibited by rifampicin, YdbR mRNA is stably appeared at 15℃, but very unstable and degraded at 37℃. Also, we cloned 4 gene of DeaD box RNA helicase and purified these enzyme. further studies will be tried to understand the biochemical characterizations of DEAD box RNA helicase in Bacillus subtilis.
There are four DEAD-box RNA helicases (YdbR, YqFr, DeaD, YfmL) in Bacillus subtilis. The deletion mutants of YdbR, YqFr, DeaD, and YfmL were constructed by DJ-PCR (Double Joint PCR) method. The knock out mutants were prepared with B. subtilis wild type Cu1065. Growth rate of DYqfR, DDeaD, and DYfmL are nearly same compared with the growth of the wild type at 37℃. with LB complete media. On the other hands, the deletion mutant of YdbR showed reduced growth rate compared with the wild type. And DYdbR, DYqfR, DDeaD, and DYfmL showed slower growth rate compared with wild type at 22℃. In particular, the growth of YdbR null mutant is not well. The double deletion mutants of four genes (YdbR, YqFr, DeaD, and YfmL) showed reduced growth compared to the wild type at 22℃ and 37℃, While the double mutants showed nearly same growth rate compared to the wild type at 42℃. Specially, DYdbR/DYfmL double mutant showed the slowest growth rate. The growth of triple or quadruple deletion mutants also showed similar results at 22℃, 37℃ and 42℃. The same measurement of growth rate were tried with minimal media and all confirmed the same results compared to the results with LB complete media. For growth analysis of mutants by cold shock, we cultured cell with minimal or complete media at 37℃ and then transfer to cold condition. Among the four single deletion mutants, DYdbR showed the slowest growth rate in cold low shock conditions. To identify the gene expression at lower temperature (22℃). We tried Northern blot analysis after cultivation of Cu1065 cell at 37℃ or 22℃, the purified RNA were analyzed and showed that YdbR is strongly induced and YqfR is moderately induced at 22℃. Also, the cold shock experiment (cultivation of the cell at 37℃ and time variated cold shock at 22℃) confirmed that YdbR is strongly induced by cold shock. After cultivation of Cu1065 at 37℃(OD_(600)=0.5), the cells were treated with rifampicin at 37℃ or 15℃. and Northern blot analysis were tried. In this experiment, YdbR mRNA was sharply disappear at 37℃, but a lot of amount of YdbR mRNA was still existed at 22℃. This means that although transcription is inhibited by rifampicin, YdbR mRNA is stably appeared at 15℃, but very unstable and degraded at 37℃. Also, we cloned 4 gene of DeaD box RNA helicase and purified these enzyme. further studies will be tried to understand the biochemical characterizations of DEAD box RNA helicase in Bacillus subtilis.
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