식물의 세포사멸(programmed cell death, PCD)은 병원체에 대한 저항성 반응에 있어서 중요한 기작으로 알려져 있다. 세포사멸 관련 유전자를 선발하고 그 기능을 확인하기 위해 microarray 분석법을 이용하였다. 야생종 담배 (Nicotiana benthamiana, 이하 담배)에 과민성 반응(...
식물의 세포사멸(programmed cell death, PCD)은 병원체에 대한 저항성 반응에 있어서 중요한 기작으로 알려져 있다. 세포사멸 관련 유전자를 선발하고 그 기능을 확인하기 위해 microarray 분석법을 이용하였다. 야생종 담배 (Nicotiana benthamiana, 이하 담배)에 과민성 반응(hypersensitive response, HR)을 유도하기 위해 식물의 저항성 유전자(애기장대 Dijon-17의 HRT 유전자)와 그에 상응하는 비병원성 유전자(Turnip crinkle virus, TCV의 외피 단백질)를 함께 처리하고 동물에서 세포사멸을 유도하는 Bcl-2 그룹 중 하나인 Bax를 처리하였다. 처리한 담배 잎으로부터 24시간 후, 전체 RNA를 확보하고 4,685개의 고추(Capsicum annuum L. cv. Bukang) 유전자가 담긴 cDNA microarray를 이용하여 발현이 크게 달라지는 39개의 유전자를 선발하고, 이들 유전자를 세포사멸 관련 유전자(programmed cell death-responsive genes, PRGs)로 명명하였다. 세포사멸 관련 유전자의 발현 양상을 다양한 고추 조직에서 역전사(reverse transcription) PCR법으로 확인한 결과 대부분의 유전자들이 모든 조직에서 높은 발현을 보이는 것을 알 수 있었으며 하나의 조직에서 특이적인 발현을 보이는 유전자는 확인되지 않았다. 또한, 다양한 식물-병원체 상호작용(plant-pathogen interaction)에서 세포사멸 관련 유전자의 발현을 역전사 PCR법으로 확인하였다. 첫째, 콩에 병을 일으키는 세균성 병원균(Xanthomonas axonopodis pv. glycines 8ra)을 고추에 접종하여 비기주 저항성(non-host resistance)을 유도한 반응에서는 MARB, NAC3, CBTR, WD40RP, NoLP, C3HC4ZF 유전자 발현은 증가하였으며, GRP와 RingZF 유전자 발현은 감소하였다. 둘째, 고추 세균성 점무늬병을 일으키는 병원균(Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria)에 상응하는 저항성 유전자(Bs3)를 갖고 있는 고추(Early Calwonder-30R)에서 WD40RP, C3HC4ZF, CBTR 유전자는 비병원성 유전자를 갖고 있는 병원균(X. a. pv. vesicatoria race 1)과의 반응에서, 그리고 CRP, HDLP, NAC3 유전자는 비병원성 유전자를 갖고 있지 않은 병원균(X. a. pv. vesicatoria race 3)과의 반응에서 각각 발현이 증가되었다. 선발된 39개 유전자의 식물 병저항성 반응에 대한 역할을 알아보기 위하여 바이러스-유도 유전자침묵(virus-induced gene silencing, VIGS) 방법으로 목적 유전자의 발현을 감소시키고 다양한 병원균을 처리하여 세포사멸 및 저항성 반응을 확인하였다. 목적 유전자 발현이 감소된 일부식물은 정상적인 생장이 이루어지지 않은 것(MARB), 엽록소 발달이 감소되어 잎의 색이 노란색으로 변한 것(LASF), 대조구와 비교해 생장이 감소된 것(ULIM, RingZF, HDLP, WD40RP)처럼 특이적인 표현형을 보이는 것이 있었다. 첫째, 고추에 감염 능력이 없는 TMV를 접종한 실험에서 NAC3, MARB, ULIM, HLP, CBTR, CeWall, ATLS1, NoLP, CDPK, ACPD, LASF와 같은 유전자의 발현이 감소된 식물에서 TMV의 감염 및 증식이 확인되었다. 둘째, 고추 세균성 점무늬병을 일으키는 병원균(X. a. pv. vesicatoria)을 처리한 실험에서는 LASF 또는 HDLP 유전자가 감소된 식물에서 대조구보다 높은 증식을 높았으며, DC1.2, NAC3, ACP 유전자 발현이 감소된 식물에서는 낮은 증식을 보였다. 셋째, 콩에 병을 일으키는 세균성 병원균(X. a. pv. glycines 8ra)을 고추에 접종하였을때 일어나는 세포사멸 반응에서는 MARB, CBTR, NoLP, LASF, ATLS1과 같은 유전자 발현이 감소된 식물에서 세포사멸이 억제 되었다. 위의 실험결과에서 선발된 유전자들은 식물의 세포사멸 및 저항성 반응에 있어 중요한 역할을 할 것으로 생각되며, 이 유전자들의 기능연구를 통해 식물의 저항성 반응기작을 더 깊이 있게 이해할 수 있을 것이다. 식물에서는 곰팡이, 세균, 바이러스와 같은 다양한 종류의 병원체 및 다른 요인에 의해 세포사멸이 유도된다. 이러한 다양한 요인에 의해 유도되어지는 세포사멸을 조절하는 유전자들의 관련성 및 그 기능을 알아보기 위해 여섯 가지의 세포사멸 유도인자를 담배에 처리하였다. 1) HRT 유전자와 TCV 외피 단백질을 함께 처리(HRT/CP), 2) 토마토 저항성 유전자(Pto)와 비병원성 유전자 (avrPto)를 함께 처리(Pto/avrPto), 3) Bax, 4) 담배에 세포사멸을 유도하는 oomycete의 INF1, 5) 담배에 세포사멸을 유도하는 oomycete의 NPP1, 6) 담배에 세포사멸을 유도하는 세균성 병원균(Pseudomonas syringae pv. syringae 61, Pss 61)과 이에 대한 대조구도 함께 처리하였다. 처리한 담배 잎으로부터 24시간 후, 전체 RNA를 확보하고 8,700개의 토마토 유전자가 담긴 cDNA microarray를 이용하여 하나 또는 그 이상의 세포사멸 조건에서 발현이 크게 달라지는 유전자 368개를 선발하였다. 선발된 유전자 중에서 125개의 유전자는 세포사멸 반응 동안에 발현이 증가하였으며, 243개의 유전자 발현은 감소하였다. 각 세포사멸 반응에 있어 선발된 368개의 유전자를 hierarchical clustering 분석 방법으로 발현 양상을 비교한 결과, Pto/avrPto와 Bax에 의해 유도되는 세포사멸 반응에서의 유전자 발현이 가장 높은 유사성을 보였으며 HRT/CP, Pss61 순서로 Pto/avrPto와 높은 유사성을 보였다. NPP1과 INF1 처리에서는 발현이 증가된 유전자들은 위의 네 가지의 세포사멸과 유사하였지만, 발현이 감소된 유전자들의 발현 경향성은 차이를 보이는 것을 확인 할 수 있었다. 선발된 유전자들을 지금까지 밝혀진 기능별로 그룹을 나눠보면 cell cycles, cell wall, defense, redox control, development, energy, light reaction, metabolism, hormone signaling, protein biosynthesis and degradation, signal transduction, stress, structure, transcription, transporter로 나눌 수 있으며, 이 중에서 metabolism, signal transduction, transporter, transcription과 관련된 유전자들이 많은 수를 차지하였다. 또한, 아직까지 그 기능이 밝혀지지 않은 유전자들도 많은 수를 차지하였다. 식물의 병 저항성과의 관련성을 알아보기 위해 선발된 유전자 중에서 전사조절 인자 11개를 담배로부터 유전자 침묵용 벡터에 삽입하였다. 바이러스(TCV)에 대한 저항성 유전자(HRT)를 갖고 있는 형질전환 담배에 이들 11개 유전자의 발현을 각각 감소시킨 후, 바이러스에 대한 저항성을 관찰하였다. 칩 실험결과에서 발현이 낮았던 4개의 유전자는 바이러스에 대한 저항성 반응에 있어서 차이를 나타내지 않았다. 하지만, microarray 분석 결과에서 발현이 높았던 7개의 유전자 중에서 4개는 그 발현이 낮아지도록 유도한 식물에서 바이러스에 대한 저항성이 감소되었다. 본 실험결과로 서로 다른 유도체에 의한 세포사멸 반응 시, 많은 유전자들이 공통적으로 조절되어 지는 것을 확인할 수 있었으며 세포사멸 관련 유전자를 선발하고 그 기능을 연구하는데 있어 microarray 분석법과 바이러스-유도 유전자침묵을 이용한 기능연구 방법이 효과적임을 알 수 있었다. 칩 실험으로부터 선발 된 39개 유전자를 바이러스-유도 유전자침묵 방법을 이용하여 담배에서 감소시키고 세포사멸 유도체를 처리하여 그 반응을 관찰한 결과, plastid의 MEP 경로의 마지막 단계에 위치하고 있는 LytB 유전자를 선발하였다. 이 유전자의 기능분석을 위해 담배로부터 유전자(NbLytB)를 분리하였다. 분리한 유전자는 462개의 아미노산을 가지고 있으며 쌍떡잎 및 외떡잎식물 그리고 원핵생물의 LytB 유전자와 아미노산 서열을 비교한 결과, NbLytB는 다른 가지과 식물과 매우 높은 유사성을 보였을 뿐만 아니라 다른 과의 식물과도 높은 유사성을 보였다. NbLytB 유전자 발현은 식물 호르몬 MeJA에 의해 발현이 크게 증가하였으며 에틸렌에 의해서는 약하게 감소되었다. NbLytB 유전자 발현을 감소시킨 식물은 잎이 하얗게 되고 생장이 위축되었으며 세포학적 관찰결과 엽록체 및 미토콘드리아의 발달이 제대로 되지 않는 것을 관찰하였다. NbLytB 유전자 발현을 감소시킨 담배 잎에 다양한 세포사멸 유도인자 처리결과 Bax에 의해 유도되는 세포사멸이 가장 강하게 억제되는 것을 관찰하였다. 세포사멸 억제의 원인을 알아보기 위해 세포사멸의 초기 신호로 중요한 활성산소를 염색법을 이용하여 확인한 결과 Bax 처리 후에도 활성산소가 축적되지 않는 것을 확인하였다. 그리고 세포사멸이 유도될 때 나타나는 특징 중 하나인 병 저항성 관련유전자(pathogenesis-related gene, PR)들의 발현도 대조구와 비교하여 매우 낮았으며 이와 더불어 담배에 병을 일으키는 세균성 병원균에 대한 감수성도 크게 증가하였다. NbLytB 유전자 발현을 감소시켰을 때, 식물이 보이는 표현형을 제외하고 NbLytB 유전자 및 MEP 신호전달 경로가 세포사멸 및 저항성에 연관되어 있는가를 확인하기 위해 MEP 경로를 특이적으로 억제하는 억제제(fosmidomycin)를 처리하였다. 억제제를 처리한 식물은 3일 후부터 위쪽 잎에서 하얗게 변하는 표현형이 관찰되었으나 처리한 잎에서는 색이나 모양의 변화가 관찰되지 않았다. 억제제를 처리한 잎에서는 NbLytB 유전자 발현을 감소시킨 잎과 동일하게 Bax에 의해 유도되는 세포사멸이 억제되었으며 PR 유전자의 발현 감소 및 감수성 증가와 같은 동일한 결과를 확인할 수 있었다. 이것으로 식물의 plastid에 위치한 MEP 경로가 식물의 세포사멸과 병 저항성에 중요한 역할을 한다는 것을 확인 할 수 있었다.
식물의 세포사멸(programmed cell death, PCD)은 병원체에 대한 저항성 반응에 있어서 중요한 기작으로 알려져 있다. 세포사멸 관련 유전자를 선발하고 그 기능을 확인하기 위해 microarray 분석법을 이용하였다. 야생종 담배 (Nicotiana benthamiana, 이하 담배)에 과민성 반응(hypersensitive response, HR)을 유도하기 위해 식물의 저항성 유전자(애기장대 Dijon-17의 HRT 유전자)와 그에 상응하는 비병원성 유전자(Turnip crinkle virus, TCV의 외피 단백질)를 함께 처리하고 동물에서 세포사멸을 유도하는 Bcl-2 그룹 중 하나인 Bax를 처리하였다. 처리한 담배 잎으로부터 24시간 후, 전체 RNA를 확보하고 4,685개의 고추(Capsicum annuum L. cv. Bukang) 유전자가 담긴 cDNA microarray를 이용하여 발현이 크게 달라지는 39개의 유전자를 선발하고, 이들 유전자를 세포사멸 관련 유전자(programmed cell death-responsive genes, PRGs)로 명명하였다. 세포사멸 관련 유전자의 발현 양상을 다양한 고추 조직에서 역전사(reverse transcription) PCR법으로 확인한 결과 대부분의 유전자들이 모든 조직에서 높은 발현을 보이는 것을 알 수 있었으며 하나의 조직에서 특이적인 발현을 보이는 유전자는 확인되지 않았다. 또한, 다양한 식물-병원체 상호작용(plant-pathogen interaction)에서 세포사멸 관련 유전자의 발현을 역전사 PCR법으로 확인하였다. 첫째, 콩에 병을 일으키는 세균성 병원균(Xanthomonas axonopodis pv. glycines 8ra)을 고추에 접종하여 비기주 저항성(non-host resistance)을 유도한 반응에서는 MARB, NAC3, CBTR, WD40RP, NoLP, C3HC4ZF 유전자 발현은 증가하였으며, GRP와 RingZF 유전자 발현은 감소하였다. 둘째, 고추 세균성 점무늬병을 일으키는 병원균(Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria)에 상응하는 저항성 유전자(Bs3)를 갖고 있는 고추(Early Calwonder-30R)에서 WD40RP, C3HC4ZF, CBTR 유전자는 비병원성 유전자를 갖고 있는 병원균(X. a. pv. vesicatoria race 1)과의 반응에서, 그리고 CRP, HDLP, NAC3 유전자는 비병원성 유전자를 갖고 있지 않은 병원균(X. a. pv. vesicatoria race 3)과의 반응에서 각각 발현이 증가되었다. 선발된 39개 유전자의 식물 병저항성 반응에 대한 역할을 알아보기 위하여 바이러스-유도 유전자침묵(virus-induced gene silencing, VIGS) 방법으로 목적 유전자의 발현을 감소시키고 다양한 병원균을 처리하여 세포사멸 및 저항성 반응을 확인하였다. 목적 유전자 발현이 감소된 일부식물은 정상적인 생장이 이루어지지 않은 것(MARB), 엽록소 발달이 감소되어 잎의 색이 노란색으로 변한 것(LASF), 대조구와 비교해 생장이 감소된 것(ULIM, RingZF, HDLP, WD40RP)처럼 특이적인 표현형을 보이는 것이 있었다. 첫째, 고추에 감염 능력이 없는 TMV를 접종한 실험에서 NAC3, MARB, ULIM, HLP, CBTR, CeWall, ATLS1, NoLP, CDPK, ACPD, LASF와 같은 유전자의 발현이 감소된 식물에서 TMV의 감염 및 증식이 확인되었다. 둘째, 고추 세균성 점무늬병을 일으키는 병원균(X. a. pv. vesicatoria)을 처리한 실험에서는 LASF 또는 HDLP 유전자가 감소된 식물에서 대조구보다 높은 증식을 높았으며, DC1.2, NAC3, ACP 유전자 발현이 감소된 식물에서는 낮은 증식을 보였다. 셋째, 콩에 병을 일으키는 세균성 병원균(X. a. pv. glycines 8ra)을 고추에 접종하였을때 일어나는 세포사멸 반응에서는 MARB, CBTR, NoLP, LASF, ATLS1과 같은 유전자 발현이 감소된 식물에서 세포사멸이 억제 되었다. 위의 실험결과에서 선발된 유전자들은 식물의 세포사멸 및 저항성 반응에 있어 중요한 역할을 할 것으로 생각되며, 이 유전자들의 기능연구를 통해 식물의 저항성 반응기작을 더 깊이 있게 이해할 수 있을 것이다. 식물에서는 곰팡이, 세균, 바이러스와 같은 다양한 종류의 병원체 및 다른 요인에 의해 세포사멸이 유도된다. 이러한 다양한 요인에 의해 유도되어지는 세포사멸을 조절하는 유전자들의 관련성 및 그 기능을 알아보기 위해 여섯 가지의 세포사멸 유도인자를 담배에 처리하였다. 1) HRT 유전자와 TCV 외피 단백질을 함께 처리(HRT/CP), 2) 토마토 저항성 유전자(Pto)와 비병원성 유전자 (avrPto)를 함께 처리(Pto/avrPto), 3) Bax, 4) 담배에 세포사멸을 유도하는 oomycete의 INF1, 5) 담배에 세포사멸을 유도하는 oomycete의 NPP1, 6) 담배에 세포사멸을 유도하는 세균성 병원균(Pseudomonas syringae pv. syringae 61, Pss 61)과 이에 대한 대조구도 함께 처리하였다. 처리한 담배 잎으로부터 24시간 후, 전체 RNA를 확보하고 8,700개의 토마토 유전자가 담긴 cDNA microarray를 이용하여 하나 또는 그 이상의 세포사멸 조건에서 발현이 크게 달라지는 유전자 368개를 선발하였다. 선발된 유전자 중에서 125개의 유전자는 세포사멸 반응 동안에 발현이 증가하였으며, 243개의 유전자 발현은 감소하였다. 각 세포사멸 반응에 있어 선발된 368개의 유전자를 hierarchical clustering 분석 방법으로 발현 양상을 비교한 결과, Pto/avrPto와 Bax에 의해 유도되는 세포사멸 반응에서의 유전자 발현이 가장 높은 유사성을 보였으며 HRT/CP, Pss61 순서로 Pto/avrPto와 높은 유사성을 보였다. NPP1과 INF1 처리에서는 발현이 증가된 유전자들은 위의 네 가지의 세포사멸과 유사하였지만, 발현이 감소된 유전자들의 발현 경향성은 차이를 보이는 것을 확인 할 수 있었다. 선발된 유전자들을 지금까지 밝혀진 기능별로 그룹을 나눠보면 cell cycles, cell wall, defense, redox control, development, energy, light reaction, metabolism, hormone signaling, protein biosynthesis and degradation, signal transduction, stress, structure, transcription, transporter로 나눌 수 있으며, 이 중에서 metabolism, signal transduction, transporter, transcription과 관련된 유전자들이 많은 수를 차지하였다. 또한, 아직까지 그 기능이 밝혀지지 않은 유전자들도 많은 수를 차지하였다. 식물의 병 저항성과의 관련성을 알아보기 위해 선발된 유전자 중에서 전사조절 인자 11개를 담배로부터 유전자 침묵용 벡터에 삽입하였다. 바이러스(TCV)에 대한 저항성 유전자(HRT)를 갖고 있는 형질전환 담배에 이들 11개 유전자의 발현을 각각 감소시킨 후, 바이러스에 대한 저항성을 관찰하였다. 칩 실험결과에서 발현이 낮았던 4개의 유전자는 바이러스에 대한 저항성 반응에 있어서 차이를 나타내지 않았다. 하지만, microarray 분석 결과에서 발현이 높았던 7개의 유전자 중에서 4개는 그 발현이 낮아지도록 유도한 식물에서 바이러스에 대한 저항성이 감소되었다. 본 실험결과로 서로 다른 유도체에 의한 세포사멸 반응 시, 많은 유전자들이 공통적으로 조절되어 지는 것을 확인할 수 있었으며 세포사멸 관련 유전자를 선발하고 그 기능을 연구하는데 있어 microarray 분석법과 바이러스-유도 유전자침묵을 이용한 기능연구 방법이 효과적임을 알 수 있었다. 칩 실험으로부터 선발 된 39개 유전자를 바이러스-유도 유전자침묵 방법을 이용하여 담배에서 감소시키고 세포사멸 유도체를 처리하여 그 반응을 관찰한 결과, plastid의 MEP 경로의 마지막 단계에 위치하고 있는 LytB 유전자를 선발하였다. 이 유전자의 기능분석을 위해 담배로부터 유전자(NbLytB)를 분리하였다. 분리한 유전자는 462개의 아미노산을 가지고 있으며 쌍떡잎 및 외떡잎식물 그리고 원핵생물의 LytB 유전자와 아미노산 서열을 비교한 결과, NbLytB는 다른 가지과 식물과 매우 높은 유사성을 보였을 뿐만 아니라 다른 과의 식물과도 높은 유사성을 보였다. NbLytB 유전자 발현은 식물 호르몬 MeJA에 의해 발현이 크게 증가하였으며 에틸렌에 의해서는 약하게 감소되었다. NbLytB 유전자 발현을 감소시킨 식물은 잎이 하얗게 되고 생장이 위축되었으며 세포학적 관찰결과 엽록체 및 미토콘드리아의 발달이 제대로 되지 않는 것을 관찰하였다. NbLytB 유전자 발현을 감소시킨 담배 잎에 다양한 세포사멸 유도인자 처리결과 Bax에 의해 유도되는 세포사멸이 가장 강하게 억제되는 것을 관찰하였다. 세포사멸 억제의 원인을 알아보기 위해 세포사멸의 초기 신호로 중요한 활성산소를 염색법을 이용하여 확인한 결과 Bax 처리 후에도 활성산소가 축적되지 않는 것을 확인하였다. 그리고 세포사멸이 유도될 때 나타나는 특징 중 하나인 병 저항성 관련유전자(pathogenesis-related gene, PR)들의 발현도 대조구와 비교하여 매우 낮았으며 이와 더불어 담배에 병을 일으키는 세균성 병원균에 대한 감수성도 크게 증가하였다. NbLytB 유전자 발현을 감소시켰을 때, 식물이 보이는 표현형을 제외하고 NbLytB 유전자 및 MEP 신호전달 경로가 세포사멸 및 저항성에 연관되어 있는가를 확인하기 위해 MEP 경로를 특이적으로 억제하는 억제제(fosmidomycin)를 처리하였다. 억제제를 처리한 식물은 3일 후부터 위쪽 잎에서 하얗게 변하는 표현형이 관찰되었으나 처리한 잎에서는 색이나 모양의 변화가 관찰되지 않았다. 억제제를 처리한 잎에서는 NbLytB 유전자 발현을 감소시킨 잎과 동일하게 Bax에 의해 유도되는 세포사멸이 억제되었으며 PR 유전자의 발현 감소 및 감수성 증가와 같은 동일한 결과를 확인할 수 있었다. 이것으로 식물의 plastid에 위치한 MEP 경로가 식물의 세포사멸과 병 저항성에 중요한 역할을 한다는 것을 확인 할 수 있었다.
Programmed cell death (PCD) is a fundamental part of plant defense, including the pathogen-induced hypersensitive response (HR). To elucidate molecular mechanisms of pathogen-induced PCD, 39 genes were screened using a cDNA microarray analysis in Nicotiana benthamiana: these genes were differentiall...
Programmed cell death (PCD) is a fundamental part of plant defense, including the pathogen-induced hypersensitive response (HR). To elucidate molecular mechanisms of pathogen-induced PCD, 39 genes were screened using a cDNA microarray analysis in Nicotiana benthamiana: these genes were differentially expressed during pathogen-induced PCD and named programmed cell death responsive genes (PRGs). For further identification of expression patterns of these genes in response to pathogens, RT-PCR analysis was performed using pepper leaves after treatment with bacteria pathogens Xanthomonas axonopodis pv. glycines 8ra and X. a. pv. vesicatoria. Nine of the 39 PRGs in pepper plant, MARB, NAC3, CBTR, WD40RP, NoLP, C3HC4ZF, GRP, RingZF, and HDLP, displayed differential expression by pathogen infections. Subsequently, phenotypes in response to various pathogens, such as Tobacco mosaic virus, X. a. pv. glycines 8ra, and X. a. pv. vesicatoria race 1, were analyzed after suppression of each 39 PRG using virus-induced gene silencing (VIGS). The variations in phenotypes indicated that 13 genes, NAC3, MARB, ULIM, HDLP, CBTR, CeWall, ATLS1, NoLP, CDPK, ACPD, LASF, DC1.2, and ACP, may be involved in PCD and/or resistance response. Although there are many characteristics reported from different types of PCD events, it remains unknown whether a common or specific molecular mechanism of various types of PCD in plants. To compare the transcriptional changes by treatment with six PCD-inducing elicitors, such as virus (HRT/CP), bacteria (Pto-avrPto and Pseudomonas syringae pv. syringae 61), oomycetes (INF1 and NPP1), and mammalian pro-apoptotic protein (Bax), gene expression was determined using a cDNA microarray in N. benthamiana. Total 368 genes were differentially expressed in response to PCD-inducing elicitors: of these, 34% was up-regulated and the rest was down- regulated. Most of the up-regulated genes were involved in defense, redox control, hormone signaling, protein metabolism, signal transduction and transcription, whereas down-regulated genes were related to light reaction-, cell wall-, and nucleic acid-metabolism. Hierarchical clustering analysis of 368 PRGs showed similar expression profiles in response to six elicitors. These results demonstrate that six PCD-inducing elicitors possess a common element for PCD induction. To identify functions of the 39 genes related to PCD, VIGS was performed in N. benthamiana. Silencing of LytB was found to compromise the PCD mediated by Bax, HRT/CP, and Pto/avrPto. The homologous gene of LytB in N. benthamiana was isolated and named NbLytB. Suppression of the NbLytB using VIGS resulted in severe growth retardation and albino phenotype as well as deformation of chloroplast and mitochondria. Interestingly, NbLytB suppression inhibits PCD triggered by Bax and significantly reduced endogenous level of hydrogen peroxide in N. benthamiana. In addition, NbLytB silencing plants were more susceptible to infection by P. syringae pv. tabaci and Tobacco mosaic virus. This enhanced degree of susceptibility showed the correlation with transcript levels of PR1a and PR2. NbLytB is known to control the last step of the methylerythritol phosphate (MEP) pathway for isoprenoid biosynthesis in plant plastid. Effect of NbLytB suppression was identical with treatment of the MEP inhibitor in terms of the suppression of PCD, decreased PR genes expression, and enhanced susceptibility to P. s. pv. tabaci. Based on these results, NbLytB plays an important role in PCD and resistance responses to pathogens in N. benthamiana. The results of these researches could be concludes that, 1) microarray analysis and VIGS were useful tools to characterize genes involved in PCD and defense, 2) six PCD-triggered elicitors probably possess common element to induce PCD, 3) the MEP pathway has a critical role in PCD and resistance responses to pathogens in plants.
Programmed cell death (PCD) is a fundamental part of plant defense, including the pathogen-induced hypersensitive response (HR). To elucidate molecular mechanisms of pathogen-induced PCD, 39 genes were screened using a cDNA microarray analysis in Nicotiana benthamiana: these genes were differentially expressed during pathogen-induced PCD and named programmed cell death responsive genes (PRGs). For further identification of expression patterns of these genes in response to pathogens, RT-PCR analysis was performed using pepper leaves after treatment with bacteria pathogens Xanthomonas axonopodis pv. glycines 8ra and X. a. pv. vesicatoria. Nine of the 39 PRGs in pepper plant, MARB, NAC3, CBTR, WD40RP, NoLP, C3HC4ZF, GRP, RingZF, and HDLP, displayed differential expression by pathogen infections. Subsequently, phenotypes in response to various pathogens, such as Tobacco mosaic virus, X. a. pv. glycines 8ra, and X. a. pv. vesicatoria race 1, were analyzed after suppression of each 39 PRG using virus-induced gene silencing (VIGS). The variations in phenotypes indicated that 13 genes, NAC3, MARB, ULIM, HDLP, CBTR, CeWall, ATLS1, NoLP, CDPK, ACPD, LASF, DC1.2, and ACP, may be involved in PCD and/or resistance response. Although there are many characteristics reported from different types of PCD events, it remains unknown whether a common or specific molecular mechanism of various types of PCD in plants. To compare the transcriptional changes by treatment with six PCD-inducing elicitors, such as virus (HRT/CP), bacteria (Pto-avrPto and Pseudomonas syringae pv. syringae 61), oomycetes (INF1 and NPP1), and mammalian pro-apoptotic protein (Bax), gene expression was determined using a cDNA microarray in N. benthamiana. Total 368 genes were differentially expressed in response to PCD-inducing elicitors: of these, 34% was up-regulated and the rest was down- regulated. Most of the up-regulated genes were involved in defense, redox control, hormone signaling, protein metabolism, signal transduction and transcription, whereas down-regulated genes were related to light reaction-, cell wall-, and nucleic acid-metabolism. Hierarchical clustering analysis of 368 PRGs showed similar expression profiles in response to six elicitors. These results demonstrate that six PCD-inducing elicitors possess a common element for PCD induction. To identify functions of the 39 genes related to PCD, VIGS was performed in N. benthamiana. Silencing of LytB was found to compromise the PCD mediated by Bax, HRT/CP, and Pto/avrPto. The homologous gene of LytB in N. benthamiana was isolated and named NbLytB. Suppression of the NbLytB using VIGS resulted in severe growth retardation and albino phenotype as well as deformation of chloroplast and mitochondria. Interestingly, NbLytB suppression inhibits PCD triggered by Bax and significantly reduced endogenous level of hydrogen peroxide in N. benthamiana. In addition, NbLytB silencing plants were more susceptible to infection by P. syringae pv. tabaci and Tobacco mosaic virus. This enhanced degree of susceptibility showed the correlation with transcript levels of PR1a and PR2. NbLytB is known to control the last step of the methylerythritol phosphate (MEP) pathway for isoprenoid biosynthesis in plant plastid. Effect of NbLytB suppression was identical with treatment of the MEP inhibitor in terms of the suppression of PCD, decreased PR genes expression, and enhanced susceptibility to P. s. pv. tabaci. Based on these results, NbLytB plays an important role in PCD and resistance responses to pathogens in N. benthamiana. The results of these researches could be concludes that, 1) microarray analysis and VIGS were useful tools to characterize genes involved in PCD and defense, 2) six PCD-triggered elicitors probably possess common element to induce PCD, 3) the MEP pathway has a critical role in PCD and resistance responses to pathogens in plants.
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