본 실험에서 바이오에너지 작물인 유채 (Brassica napus L.)의 종자와 배축을 이용하고, 최근 많이 이용되는 형질전환 기술인 유전자총과 아그로박리움을 이용하여 환경복합저항성 유전자 (AtSIZ)와 수량증대 유전자 (ORE 7)가 도입된 형질전환체를 획득하였다. 예비실험에서 형질전환 유채식물체의 적정선발을 위해 선발약제로 사용된 PPT (phosphinotricin)의 농도를 검정한 결과, 종자의 경우 20 mg/l 그리고 배축 절편체의 경우 5 mg/l에서 고사 또는 신초형성이 억제되어 각 절편체의 선발 시 적정농도로 선정하였다. 이러한 선발조건을 기반으로 종자를 절편체로 한 유전자총 적정 조건 실험결과, 헬륨가스압력 1,350 psi (8.0%), 사출거리 6 cm (4.0%)에서 가장 높은 형질전환 효율을 나타내었다. 또한, 식물체에 도입하는 유전자의 종류에 따른 형질전환효율에서는 pCAMBIA3301:ORE 7 (8.0%)에서 가장 높은 형질전환 효율을 보였으며 같은 ...
본 실험에서 바이오에너지 작물인 유채 (Brassica napus L.)의 종자와 배축을 이용하고, 최근 많이 이용되는 형질전환 기술인 유전자총과 아그로박리움을 이용하여 환경복합저항성 유전자 (AtSIZ)와 수량증대 유전자 (ORE 7)가 도입된 형질전환체를 획득하였다. 예비실험에서 형질전환 유채식물체의 적정선발을 위해 선발약제로 사용된 PPT (phosphinotricin)의 농도를 검정한 결과, 종자의 경우 20 mg/l 그리고 배축 절편체의 경우 5 mg/l에서 고사 또는 신초형성이 억제되어 각 절편체의 선발 시 적정농도로 선정하였다. 이러한 선발조건을 기반으로 종자를 절편체로 한 유전자총 적정 조건 실험결과, 헬륨가스압력 1,350 psi (8.0%), 사출거리 6 cm (4.0%)에서 가장 높은 형질전환 효율을 나타내었다. 또한, 식물체에 도입하는 유전자의 종류에 따른 형질전환효율에서는 pCAMBIA3301:ORE 7 (8.0%)에서 가장 높은 형질전환 효율을 보였으며 같은 벡터를 사용하지만 유전자의 종류가 다른 pNB96:AtSIZ와 pNB96:ORE 12에서 각각 4.1%, 2.1%로 다른 형질전환효율을 나타내었다. 형질전환 유채의 적정한 선발조건 확립실험에서는 형질전환 후, 다양한 선발방법을 비교해 본 결과, 형질전환 후, PPT 20 mg/l이 첨가된 배지에서 4주간 배양 후, PPT 농도를 5 mg/l로 감소시킨 선발배지에서 배양한 경우 가장 생존율도 높고, 그 결과 형질전환 개체의 피해도 감소하고 선발효율도 증가하였다. 유전자총을 이용한 배축의 형질전환 시 액체배지로 전배양 8일 처리한 개체에서 가장 높은 재분화율 (8.8%)을 나타내었다. pNB96벡터 (AtSIZ, bar)를 포함하는 Agrobacterium AGL1 균주를 이용한 형질전환 실험에서 종자를 절편체로 사용할 경우 acetosyringone (AS)을 첨가하지 않은 처리구에서 4.6%로 AS 첨가 처리구 (0.7%) 보다 더 높은 형질전환 효율을 보였다. 본 연구에서는 또한 AtSIZ 유전자가 포함된 아그로박테리움을 먼저 배축에 접종 시킨 후, ORE 7 유전자가 포함된 벡터가 코팅된 gold 입자를 유전자총을 이용하여 형질전환 시키는 co-transformation도 실시하여 두 유전자가 모두 들어간 co-transformation 유채 형질전환체도 비록 낮은 효율이지만 획득하였다. 환경복합저항성유전자의 발현을 확인하기위해 AtSIZ 유전자가 도입된 형질전환체의 잎 조각을 200 mM NaCl 용액에 침지 처리 후 엽록소 A 함량의 변화를 측정한 결과 총 13개체 중 4개체에서 엽록소 A의 감소량이 작거나 증가하였다. 또한 본 연구에서 생산된 형질전환 유체 식물체의 PCR 검정을 통해 제초제 저항성 유전자 (bar), 환경복합저항성유전자 (AtSIZ)와 수량증대 및 노화억제 유전자 (ORE 7)가 도입되었음을 확인하였다.
본 실험에서 바이오에너지 작물인 유채 (Brassica napus L.)의 종자와 배축을 이용하고, 최근 많이 이용되는 형질전환 기술인 유전자총과 아그로박리움을 이용하여 환경복합저항성 유전자 (AtSIZ)와 수량증대 유전자 (ORE 7)가 도입된 형질전환체를 획득하였다. 예비실험에서 형질전환 유채식물체의 적정선발을 위해 선발약제로 사용된 PPT (phosphinotricin)의 농도를 검정한 결과, 종자의 경우 20 mg/l 그리고 배축 절편체의 경우 5 mg/l에서 고사 또는 신초형성이 억제되어 각 절편체의 선발 시 적정농도로 선정하였다. 이러한 선발조건을 기반으로 종자를 절편체로 한 유전자총 적정 조건 실험결과, 헬륨가스압력 1,350 psi (8.0%), 사출거리 6 cm (4.0%)에서 가장 높은 형질전환 효율을 나타내었다. 또한, 식물체에 도입하는 유전자의 종류에 따른 형질전환효율에서는 pCAMBIA3301:ORE 7 (8.0%)에서 가장 높은 형질전환 효율을 보였으며 같은 벡터를 사용하지만 유전자의 종류가 다른 pNB96:AtSIZ와 pNB96:ORE 12에서 각각 4.1%, 2.1%로 다른 형질전환효율을 나타내었다. 형질전환 유채의 적정한 선발조건 확립실험에서는 형질전환 후, 다양한 선발방법을 비교해 본 결과, 형질전환 후, PPT 20 mg/l이 첨가된 배지에서 4주간 배양 후, PPT 농도를 5 mg/l로 감소시킨 선발배지에서 배양한 경우 가장 생존율도 높고, 그 결과 형질전환 개체의 피해도 감소하고 선발효율도 증가하였다. 유전자총을 이용한 배축의 형질전환 시 액체배지로 전배양 8일 처리한 개체에서 가장 높은 재분화율 (8.8%)을 나타내었다. pNB96벡터 (AtSIZ, bar)를 포함하는 Agrobacterium AGL1 균주를 이용한 형질전환 실험에서 종자를 절편체로 사용할 경우 acetosyringone (AS)을 첨가하지 않은 처리구에서 4.6%로 AS 첨가 처리구 (0.7%) 보다 더 높은 형질전환 효율을 보였다. 본 연구에서는 또한 AtSIZ 유전자가 포함된 아그로박테리움을 먼저 배축에 접종 시킨 후, ORE 7 유전자가 포함된 벡터가 코팅된 gold 입자를 유전자총을 이용하여 형질전환 시키는 co-transformation도 실시하여 두 유전자가 모두 들어간 co-transformation 유채 형질전환체도 비록 낮은 효율이지만 획득하였다. 환경복합저항성유전자의 발현을 확인하기위해 AtSIZ 유전자가 도입된 형질전환체의 잎 조각을 200 mM NaCl 용액에 침지 처리 후 엽록소 A 함량의 변화를 측정한 결과 총 13개체 중 4개체에서 엽록소 A의 감소량이 작거나 증가하였다. 또한 본 연구에서 생산된 형질전환 유체 식물체의 PCR 검정을 통해 제초제 저항성 유전자 (bar), 환경복합저항성유전자 (AtSIZ)와 수량증대 및 노화억제 유전자 (ORE 7)가 도입되었음을 확인하였다.
In this study, we obtained transgenic oilseed rape plants containing multiple-stress tolerance gene (AtSIZ) and yield increasing gene (ORE 7) via both Agrobacterium tumefaciens and particle bombardment with seeds and hypocotyls as explants. Before the development of transgenic oilseed rape plants, t...
In this study, we obtained transgenic oilseed rape plants containing multiple-stress tolerance gene (AtSIZ) and yield increasing gene (ORE 7) via both Agrobacterium tumefaciens and particle bombardment with seeds and hypocotyls as explants. Before the development of transgenic oilseed rape plants, the proper selective agent and its concentration should be determined. In the preliminary experiment, PPT (phosphinothricin) was selected and tested for seeds and hypocotyls. As a result, 20 mg/l was good for seed and 5 mg/l was good for hypocotyls when they are in the selection process. By using seed as an explant, 1,350 psi for helium gas pressure and 6 cm of target distance for particle bombardment showed the best results in transformation efficiency. To check the effect of different gene types, ORE 7 gene showed 8% of transformation rates, whereas AtSIZ gene showed 4.1% and ORE 12 showed only 2.1%. When we used hypocotyl explants for particle bombardment, liquid medium with 8 days of pre-culture period showed 8.8% of transgenic shoot regeneration rates. Also, proper selection regimes were tested for the increasing of selection efficiency of transformed tissues. In our study, 20 mg/l of PPT was employed in the first selection for 4 weeks after transformation. After that, they were in the second selection medium containing PPT 5 mg/l as a selective agent. Under this selection regime, more putatively transformed tissues were obtained. In the experiment of Agrobacterium-mediated transformation with seeds as explants, acetosyringone (AS)-free treatment showed the good result, as compared to AS treatment. To confirm the expression of AtSIZ gene in transgenic oilseed rape plantlets, these transgenic lines were tested with 200 mM NaCl. After that, we measured chlorophyll A content of tested plants. As a result, 4 plants of 13 transgenic plants showed the tolerance to NaCl treatment. Finally, we confirmed the presence of transgenes (bar, ORE 7 and AtSIZ genes) in transgenic oilseed rape plants by PCR analysis.
In this study, we obtained transgenic oilseed rape plants containing multiple-stress tolerance gene (AtSIZ) and yield increasing gene (ORE 7) via both Agrobacterium tumefaciens and particle bombardment with seeds and hypocotyls as explants. Before the development of transgenic oilseed rape plants, the proper selective agent and its concentration should be determined. In the preliminary experiment, PPT (phosphinothricin) was selected and tested for seeds and hypocotyls. As a result, 20 mg/l was good for seed and 5 mg/l was good for hypocotyls when they are in the selection process. By using seed as an explant, 1,350 psi for helium gas pressure and 6 cm of target distance for particle bombardment showed the best results in transformation efficiency. To check the effect of different gene types, ORE 7 gene showed 8% of transformation rates, whereas AtSIZ gene showed 4.1% and ORE 12 showed only 2.1%. When we used hypocotyl explants for particle bombardment, liquid medium with 8 days of pre-culture period showed 8.8% of transgenic shoot regeneration rates. Also, proper selection regimes were tested for the increasing of selection efficiency of transformed tissues. In our study, 20 mg/l of PPT was employed in the first selection for 4 weeks after transformation. After that, they were in the second selection medium containing PPT 5 mg/l as a selective agent. Under this selection regime, more putatively transformed tissues were obtained. In the experiment of Agrobacterium-mediated transformation with seeds as explants, acetosyringone (AS)-free treatment showed the good result, as compared to AS treatment. To confirm the expression of AtSIZ gene in transgenic oilseed rape plantlets, these transgenic lines were tested with 200 mM NaCl. After that, we measured chlorophyll A content of tested plants. As a result, 4 plants of 13 transgenic plants showed the tolerance to NaCl treatment. Finally, we confirmed the presence of transgenes (bar, ORE 7 and AtSIZ genes) in transgenic oilseed rape plants by PCR analysis.
주제어
#Agrobacterium tumefaciens Brassica napus L Co-transformation Particle bombardment Salt stress Transformation
학위논문 정보
저자
이상일
학위수여기관
건국대학교 대학원
학위구분
국내석사
학과
생명자원환경과학과
지도교수
김종보
발행연도
2011
총페이지
viii, 73 p.
키워드
Agrobacterium tumefaciens Brassica napus L Co-transformation Particle bombardment Salt stress Transformation
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